Dönüştürmek için basit ve etkili bir yöntem<em> Physcomitrella pantens</em> Protoplast açıklanmıştır. Bu yöntem için protokolleri uyarlanmıştır<em> Physocmitrella</em> Protonemal protoplast ve<em> Arabidopsis</em> Mezofil protoplast dönüşüm<sup> 1</sup>.
Physcomitrella pantens protoplast dönüştürmek için basit ve etkili bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem Physocmitrella protonemal protoplast ve Arabidopsis mezofil protoplast dönüşüm 1 protokolleri uyarlanmıştır. Verimli mitotik homolog rekombinasyon geçmesi kapasitesi nedeniyle Physcomitrella Dini ayinlerde kullanılan patenler, son yıllarda 2 önemli bir model sistem olarak ortaya çıkmıştır . Bu kapasite, Arabidopsis gibi diğer model tesislerinde görülen 3-9 hedef gen yüksek frekansları sağlar . Bu sistemin tam olarak yararlanmak için, biz yosun hücrelerin içine DNA sunmak için etkin ve kolay bir yöntem gerekir. Bu yosun dönüştürmek için en yaygın yolu, partikül bombardımanı 10 ve PEG-aracılı DNA alımı 11 . Partikül bombardımanı yüksek dönüşüm verimliliği 12 üretebilir rağmen, gen silahlar birçok laboratuvarda hazır değildir ve protokol standardize etmek zordur. Öte yandan, PEG aracılı dönüşüm uzman ekipman gerektirmeyen, ve steril bir kukuleta ile, herhangi bir laboratuvar yapılabilir. Burada, yosun protoplast dönüşüm için basit ve son derece etkili bir yöntem gösteriyor. Bu yöntem daha önce 13 DNA, en verimli protokolü bir gelişmedir mikrogram başına 120'den fazla geçici transformants üretebilir . Basitlik, verimlilik ve tekrarlanabilirlik için, bu yöntem rutin dönüşümün yanı sıra çok sayıda transformants gerektiren projeler için uygulanabilir.
Burada sunulan yöntem Physcomitrella Dini ayinlerde kullanılan patenler protoplast içine basit ve tutarlı bir DNA dönüşümü sağlar . Bu yöntem başlangıçta Arabidopsis 1 için geliştirilmiş, ancak burada Physcomitrella Dini ayinlerde kullanılan patenler, daha basit ve farklı bitki protoplast ile iyi bir performans ortaya koydu. Bu nedenle, bu yöntem, küçük değişiklikler ile diğer bitki türlerinin uygulanabilir. Optimizasyonu için olası değişiklikler MMG protoplast konsantrasyon, kuluçka süresi, MMG ve PEG / Ca çözüm içerir. (Tablo 1) Bu noktada transformants sayısı kadar DNA konsantrasyonu ile doğrusal olarak artar, çünkü bizim rutin deneyler 60 mg DNA kullanmayı tercih. Biz bitkilerin büyük bir nüfus daha fazla tarama ve analiz için izin veren tek bir 60 mg DNA dönüşümü, yaklaşık 7000 geçici transformants veya 200 istikrarlı transformants alabilir.
Dönüştürülmüş protoplast sıvı kaplama, orta ya da PRM-T ile iki yayılmış olabilir. Protoplast supercoiled plazmid dönüştürülmüş olduğu rejenerasyon sıvı kaplama orta kullanıldığında verimliliği düşük olmasına rağmen, bu yöntemi tercih etmektedir. Tablo 1'de gösterdi supercoiled plazmid DNA ile yapılan dönüşümler, çok daha fazla transformants ve bu nedenle, biz hala sıvı kaplama orta ile çok sayıda bitki elde edebilirsiniz. Ayrıca, sıvı kaplama orta protoplast yayılmasını deneyler 9,15 yıkmak, RNAi olarak geçici fenotipleri içeren deneyler için önemli olan hızlı yenilenme sağlar. Buna ek olarak üst agar yokluğunda, immün ve RT-PCR 9,15 kolay bitki izolasyon sağlar .
The authors have nothing to disclose.
LV NSF (IOS 1.002.837) tarafından desteklenen
Name of the reagent | Ingredient |
PPNH4 | 1.84 mM KH2PO4 3.4 mM Ca(NO3)2 1 mM MgSO4 2.72 mM Diammonium tartrate 54 μM FeSO4.7H2O 9.93 μM H3BO3 1.97 μM MnCl2.4H2O 0.23 μM CoCl2.6H2O 0.19 μM ZnSO4. 7H2O 0.22 μM CuSO4. 5H2O 0.10 μM Na2MoO4.2H2O 0.168 μM KI Add 0.7% agar for solid medium. |
PRM-B | PPNH4 with 6% mannitol and 0.8% agar. Add 10 mL 1M CaCl2 to 1 L before pouring plates. |
PRM-T | PPNH4 with 6% mannitol and 0.6% agar. Add 0.5 mL 1M CaCl2 to 50 mL before use. |
Liquid Plating Medium | PPNH4 with 8.5% mannitol without agar. Add 0.5 mL 1M CaCl2 to 50 mL before use. |
2% Driselase | Add 4 g of Driselase (Sigma D9515-25G) to 200 mL of 8% mannitol. Stir gently for 30 min. at room temperature, incubate 30 min. at 4°C, and stir gently for 5 min. at room temperature. Spin 2,500 g for 10 min, discard pellet. Filter with 0.22 μm, and store frozen as 10 mL aliquots. Thaw in a room temperature water bath before use. |
MMg | 0.4 M mannitol 15 mM MgCl2 4 mM MES (pH 5.7) |
PEG/Ca | 4 g PEG4000 3 mL H2O 2.5 mL 0.8 M mannitol 1 mL 1M CaCl2 |
W5 | 154 mM NaCl 125 mM CaCl2 5 mM KCl 2 mM MES (pH 5.7) |