कुशल polyethylene glycol (खूंटी) मॉस की मध्यस्थता परिवर्तन Physcomitrella patens</em
Summary
एक सरल और कुशल पद्धति को बदलने<em> Physcomitrella pantens</em> Protoplasts वर्णित है. प्रोटोकॉल से इस विधि के लिए अनुकूलित है<em> Physocmitrella</em> Protonemal मूलतत्त्व और<em> Arabidopsis</em> Mesophyll मूलतत्त्व परिवर्तन<sup> 1</sup>.
Abstract
Physcomitrella pantens protoplasts परिणत करने के लिए एक सरल और कुशल विधि वर्णित है. इस विधि Physocmitrella protonemal मूलतत्त्व और Arabidopsis mesophyll मूलतत्त्व एक परिवर्तन के लिए प्रोटोकॉल से अनुकूलित है. अपनी कुशल mitotic मुताबिक़ पुनर्संयोजन गुजरना क्षमता के कारण, Physcomitrella patens महत्वपूर्ण मॉडल प्रणाली के रूप में हाल ही में 2 वर्षों में उभरा है. इस क्षमता जीन की उच्च आवृत्तियों 3-9 लक्ष्यीकरण, जो Arabidopsis जैसे अन्य मॉडल पौधों में नहीं देखा है की अनुमति देता है. इस प्रणाली के पूर्ण लाभ लेने के लिए, हम एक प्रभावी और आसान विधि काई कोशिकाओं में डीएनए देने की जरूरत है. इस काई को बदलने के लिए सबसे आम तरीके कण 10 बमबारी और खूंटी की मध्यस्थता डीएनए तेज 11 कर रहे हैं. हालांकि कण बमबारी में एक उच्च परिवर्तन 12 दक्षता का उत्पादन कर सकते हैं, जीन बंदूकें आसानी से कई प्रयोगशालाओं के लिए उपलब्ध नहीं हैं प्रोटोकॉल के मानकीकरण के लिए मुश्किल है. दूसरी ओर, खूंटी मध्यस्थता परिवर्तन विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं करता, और किसी भी प्रयोगशाला में एक बाँझ हुड के साथ किया जा सकता है है. यहाँ, हम काई protoplasts के परिवर्तन के लिए एक सरल और अत्यधिक कुशल तरीका दिखा. इस विधि डीएनए है, जो सबसे कुशल प्रोटोकॉल से एक सुधार है माइक्रोग्राम प्रति 120 से अधिक क्षणिक transformants उत्पन्न पहले से 13 की रिपोर्ट कर सकते हैं. अपनी सादगी, दक्षता, और reproducibility की वजह से, इस विधि transformants की बड़ी संख्या दिनचर्या परिवर्तन के लिए की आवश्यकता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से परियोजनाओं के लिए लागू किया जा सकता है.
Protocol
Discussion
यहाँ प्रस्तुत विधि एक सरल और सुसंगत Physcomitrella patens protoplasts में डीएनए परिवर्तन के लिए सक्षम बनाता है. इस पद्धति का मूल एक Arabidopsis के लिए विकसित किया गया था, लेकिन हम यहाँ दिखा दिया है कि यह Physcomitrella patens, एक सरल और विभिन्न संयंत्र के protoplasts के साथ अच्छी तरह से करता है. इसलिए, इस विधि मामूली संशोधनों के साथ अन्य प्रजातियों के पौधे को लागू किया जा सकता है. अनुकूलन के लिए संभावित संशोधनों MMg MMg और / खूंटी Ca समाधान में ऊष्मायन समय में मूलतत्त्व एकाग्रता शामिल हैं. हम हमारी दिनचर्या प्रयोगों में 60 μg डीएनए का उपयोग करना चुनते हैं क्योंकि transformants की संख्या डीएनए एकाग्रता के साथ linearly इस बिंदु (1 टेबल) तक बढ़ जाती है. हम लगभग 7000 क्षणिक या एक एकल 60 μg डीएनए परिवर्तन, जो आगे और पौधों की एक बड़ी आबादी की स्क्रीनिंग के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है पर transformants 200 स्थिर transformants मिल सकता है.
तब्दील protoplasts तरल चढ़ाना मध्यम या PRM-टी के साथ या तो फैल सकता है. हालांकि उत्थान दक्षता जब तरल चढ़ाना मध्यम प्रयोग किया जाता है कम है, हम इस विधि का चयन जब protoplasts supercoiled plasmids के साथ बदल रहे थे. जैसा कि तालिका 1 में दिखाया है, supercoiled प्लास्मिड डीएनए के साथ किया परिवर्तनों कई और अधिक transformants उत्पन्न और इस प्रकार, हम अभी भी तरल चढ़ाना माध्यम के साथ पौधों की बड़ी संख्या प्राप्त कर सकते हैं. इसके अलावा, तरल चढ़ाना माध्यम से फैल protoplasts तेजी से उत्थान, जो आरएनएआई जैसे क्षणिक phenotypes, दस्तक नीचे 9,15 प्रयोगों से जुड़े प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है की अनुमति देता है. इसके अलावा शीर्ष अगर के अभाव immunostaining और RT-पीसीआर 9,15 के लिए आसान संयंत्र अलगाव के लिए अनुमति देता है .
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एल.वी. NSF द्वारा समर्थित (1002837 IOS) है
Materials
| Name of the reagent | Ingredient |
| PPNH4 | 1.84 mM KH2PO4 3.4 mM Ca(NO3)2 1 mM MgSO4 2.72 mM Diammonium tartrate 54 μM FeSO4.7H2O 9.93 μM H3BO3 1.97 μM MnCl2.4H2O 0.23 μM CoCl2.6H2O 0.19 μM ZnSO4. 7H2O 0.22 μM CuSO4. 5H2O 0.10 μM Na2MoO4.2H2O 0.168 μM KI Add 0.7% agar for solid medium. |
| PRM-B | PPNH4 with 6% mannitol and 0.8% agar. Add 10 mL 1M CaCl2 to 1 L before pouring plates. |
| PRM-T | PPNH4 with 6% mannitol and 0.6% agar. Add 0.5 mL 1M CaCl2 to 50 mL before use. |
| Liquid Plating Medium | PPNH4 with 8.5% mannitol without agar. Add 0.5 mL 1M CaCl2 to 50 mL before use. |
| 2% Driselase | Add 4 g of Driselase (Sigma D9515-25G) to 200 mL of 8% mannitol. Stir gently for 30 min. at room temperature, incubate 30 min. at 4°C, and stir gently for 5 min. at room temperature. Spin 2,500 g for 10 min, discard pellet. Filter with 0.22 μm, and store frozen as 10 mL aliquots. Thaw in a room temperature water bath before use. |
| MMg | 0.4 M mannitol 15 mM MgCl2 4 mM MES (pH 5.7) |
| PEG/Ca | 4 g PEG4000 3 mL H2O 2.5 mL 0.8 M mannitol 1 mL 1M CaCl2 |
| W5 | 154 mM NaCl 125 mM CaCl2 5 mM KCl 2 mM MES (pH 5.7) |
References
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