Un método simple y eficiente para transformar<em> Physcomitrella pantens</em> Protoplastos se describe. Este método es una adaptación de los protocolos para<em> Physocmitrella</em> Protonemal protoplastos y<em> Arabidopsis</em> Mesófilo de transformación de protoplastos<sup> 1</sup>.
El método aquí presentado permite una transformación de ADN directa y consistente en Physcomitrella patens protoplastos. Este método fue desarrollado originalmente para el 1 de Arabidopsis, pero aquí hemos demostrado que funciona bien con protoplastos de Physcomitrella patens, una planta simple y diferente. Por lo tanto, este método se puede aplicar a otras especies de plantas con modificaciones menores. Posibles modificaciones para la optimización incluyen la concentración de protoplastos en MMG, tiempo de incubación en la solución de MMG y PEG / Ca. Optamos por utilizar 60 mg de ADN en nuestros experimentos de rutina debido a que el número de transformantes se incrementa linealmente con la concentración de ADN hasta este momento (Tabla 1). Podríamos obtener unos 7.000 transformantes transitorios o 200 transformantes estables en una única de 60 mg la transformación del ADN, que permite la detección y análisis de una gran población de plantas.
Los protoplastos transformados puede ser extendido con un medio líquido o placas PRM-T. Aunque la eficiencia de la regeneración es más baja cuando el medio de recubrimiento líquido se utiliza, se elige este método cuando los protoplastos se transformaron con plásmidos superenrollado. Como se muestra en la Tabla 1, las transformaciones de hecho con el ADN de plásmido superenrollado generar transformantes muchos más y por lo tanto, podemos obtener un gran número de plantas con el medio de recubrimiento líquido. Además, la difusión de protoplastos con el medio chapado líquido permite una regeneración más rápida, lo cual es importante para los experimentos con fenotipos transitoria, como RNAi tumbar experimentos 9,15. Además de la ausencia de agar para el aislamiento de la parte superior permite planta fácil de inmunotinción y RT-PCR 9,15.
The authors have nothing to disclose.
LV es apoyado por la NSF (IOS 1002837)
Name of the reagent | Ingredient |
PPNH4 | 1.84 mM KH2PO4 3.4 mM Ca(NO3)2 1 mM MgSO4 2.72 mM Diammonium tartrate 54 μM FeSO4.7H2O 9.93 μM H3BO3 1.97 μM MnCl2.4H2O 0.23 μM CoCl2.6H2O 0.19 μM ZnSO4. 7H2O 0.22 μM CuSO4. 5H2O 0.10 μM Na2MoO4.2H2O 0.168 μM KI Add 0.7% agar for solid medium. |
PRM-B | PPNH4 with 6% mannitol and 0.8% agar. Add 10 mL 1M CaCl2 to 1 L before pouring plates. |
PRM-T | PPNH4 with 6% mannitol and 0.6% agar. Add 0.5 mL 1M CaCl2 to 50 mL before use. |
Liquid Plating Medium | PPNH4 with 8.5% mannitol without agar. Add 0.5 mL 1M CaCl2 to 50 mL before use. |
2% Driselase | Add 4 g of Driselase (Sigma D9515-25G) to 200 mL of 8% mannitol. Stir gently for 30 min. at room temperature, incubate 30 min. at 4°C, and stir gently for 5 min. at room temperature. Spin 2,500 g for 10 min, discard pellet. Filter with 0.22 μm, and store frozen as 10 mL aliquots. Thaw in a room temperature water bath before use. |
MMg | 0.4 M mannitol 15 mM MgCl2 4 mM MES (pH 5.7) |
PEG/Ca | 4 g PEG4000 3 mL H2O 2.5 mL 0.8 M mannitol 1 mL 1M CaCl2 |
W5 | 154 mM NaCl 125 mM CaCl2 5 mM KCl 2 mM MES (pH 5.7) |