一个简单而有效的方法来改造<em>小立碗pantens</em>原生质体的描述。这种方法是改编自协议<em> Physocmitrella</em> protonemal原生质体和<em>拟南芥</em>叶肉原生质体转化<sup> 1</sup>。
这里介绍的方法可以直接和一致的DNA转化成小立碗藓原生质体。该方法最初用于拟南芥 1,但在这里,我们表明,它执行与小立碗藓 ,一个简单的和不同的植物原生质体。因此,这种方法可以应用到其他植物物种,稍作修改。优化的可能的修改包括原生质体的浓度在MMG,MMG和PEG / CA解决方案的孵化时间。我们选择在我们日常的实验中使用60微克的DNA,因为转化与DNA浓度呈线性增加,直到这一点(见表1)。我们可以得到约7000瞬态转化一个单一的60微克DNA转化,这为进一步筛选和分析人口众多的植物,或200个稳定转化。
转化原生质体可以是液体电镀中等或PRM – T的蔓延。虽然再生效率较低时使用液体电镀液中,我们选择这种方法时,原生质体与超螺旋质粒转化。如表1显示,超螺旋质粒DNA的转换生成更多的转化,因此,我们仍然可以用液体电镀液中获得大量的植物。此外,传播与液体电镀液的原生质体,允许更快的再生,这是非常重要的实验涉及瞬态的表型,如RNA 干扰 ,击倒实验9,15的。此外,高层琼脂的情况下允许免疫组化和RT – PCR检测9,15容易植物隔离。
The authors have nothing to disclose.
LV是支持由美国国家科学基金会(内部监督办公室1002837)
Name of the reagent | Ingredient |
PPNH4 | 1.84 mM KH2PO4 3.4 mM Ca(NO3)2 1 mM MgSO4 2.72 mM Diammonium tartrate 54 μM FeSO4.7H2O 9.93 μM H3BO3 1.97 μM MnCl2.4H2O 0.23 μM CoCl2.6H2O 0.19 μM ZnSO4. 7H2O 0.22 μM CuSO4. 5H2O 0.10 μM Na2MoO4.2H2O 0.168 μM KI Add 0.7% agar for solid medium. |
PRM-B | PPNH4 with 6% mannitol and 0.8% agar. Add 10 mL 1M CaCl2 to 1 L before pouring plates. |
PRM-T | PPNH4 with 6% mannitol and 0.6% agar. Add 0.5 mL 1M CaCl2 to 50 mL before use. |
Liquid Plating Medium | PPNH4 with 8.5% mannitol without agar. Add 0.5 mL 1M CaCl2 to 50 mL before use. |
2% Driselase | Add 4 g of Driselase (Sigma D9515-25G) to 200 mL of 8% mannitol. Stir gently for 30 min. at room temperature, incubate 30 min. at 4°C, and stir gently for 5 min. at room temperature. Spin 2,500 g for 10 min, discard pellet. Filter with 0.22 μm, and store frozen as 10 mL aliquots. Thaw in a room temperature water bath before use. |
MMg | 0.4 M mannitol 15 mM MgCl2 4 mM MES (pH 5.7) |
PEG/Ca | 4 g PEG4000 3 mL H2O 2.5 mL 0.8 M mannitol 1 mL 1M CaCl2 |
W5 | 154 mM NaCl 125 mM CaCl2 5 mM KCl 2 mM MES (pH 5.7) |