وهناك طريقة بسيطة وفعالة لتحويل<em> Physcomitrella pantens</emيوصف> protoplasts. ويتم تكييف هذا الأسلوب من بروتوكولات<em> Physocmitrella</em> protonemal والجبلة المجردة<em> Arabidopsis</em> التحول mesophyll الجبلة المجردة<sup> 1</sup>.
وصفت طريقة بسيطة وفعالة لتحويل Physcomitrella protoplasts pantens. ويتم تكييف هذا الأسلوب من بروتوكولات لPhysocmitrella protonemal الجبلة المجردة وArabidopsis التحول الجبلة المجردة mesophyll 1. نظرا لقدرتها على الخضوع لالإنقسامية كفاءة إعادة التركيب مثلي ، فقد برزت Physcomitrella patens كنظام نموذجا هاما في السنوات الأخيرة 2. هذه القدرة تسمح للترددات عالية من استهداف الجينات 3-9 ، الذي لا ينظر في محطات أخرى مثل نموذج Arabidopsis. للاستفادة الكاملة من هذا النظام ، ونحن في حاجة الى طريقة فعالة وسهلة لإيصال الحمض النووي في خلايا الطحلب. الطرق الأكثر شيوعا لتحويل هذا الطحلب والقصف الجسيمات (10) والربط بوساطة الحمض النووي امتصاص 11. على الرغم من القصف الجسيمات يمكن أن يؤدي إلى كفاءة عالية التحول 12 ومدافع الجينات ليست متاحة بسهولة إلى العديد من المختبرات والبروتوكول من الصعب توحيد. من ناحية أخرى ، PEG التحول توسط لا يتطلب معدات متخصصة ، ويمكن أن يؤديها في أي مختبر مع غطاء العقيمة. هنا ، وتبين لنا طريقة بسيطة وفعالة للغاية لتحويل protoplasts الطحلب. هذا الأسلوب يمكن أن تولد أكثر من 120 ميكروغرام لكل عابر transformants من الحمض النووي ، وهو ما يشكل تحسنا من البروتوكول الأكثر كفاءة ذكرت سابقا 13. بسبب كفاءته ، والبساطة ، واستنساخ ، يمكن تطبيق هذه الطريقة للمشاريع التي تتطلب عددا كبيرا من transformants فضلا عن التحول الروتينية.
الطريقة المعروضة هنا يمكن تحويل الحمض النووي واضحة ومتسقة في protoplasts patens Physcomitrella. وضعت أصلا لهذا الأسلوب Arabidopsis 1 ، ولكن نحن هنا أثبت أنه يؤدي بشكل جيد مع protoplasts من patens Physcomitrella ، وهو نبات أبسط ومختلفة. ولذلك ، يمكن تطبيق هذه الطريقة على الأنواع النباتية الأخرى مع إدخال بعض التعديلات الطفيفة. التعديلات الممكنة لتحسين وتشمل تركيز الجبلة المجردة في مجموعة محمد المعجل ، فترة حضانة في الحل والربط MMG / كا. اخترنا لاستخدام الحمض النووي 60 ميكروغرام في تجاربنا الروتينية لأن عدد transformants الزيادات خطيا مع تركيز الحمض النووي حتى هذه النقطة (الجدول 1). يمكن أن نحصل على ما يقرب من 7000 transformants عابرة أو 200 transformants مستقرة على 60 ميكروغرام واحد تحول الحمض النووي ، التي تسمح لمزيد من الفحص والتحليل لعدد كبير من النباتات.
يمكن أن تكون إما تحولت protoplasts مع انتشار المتوسطة الطلاء السائل أو PRM تي. على الرغم من أن كفاءة التجدد هو أقل عندما يتم استخدام الطلاء السائل المتوسطة ، ونحن اخترت هذا الأسلوب عندما تحولت protoplasts مع البلازميدات supercoiled. وأظهرت كما في الجدول رقم 1 ، التحولات فعلت مع DNA البلازميد supercoiled توليد المزيد من transformants وبالتالي ، يمكننا الحصول على ما زالت أعداد كبيرة من النباتات المتوسطة مع الطلاء السائل. وعلاوة على ذلك ، ونشر protoplasts المتوسطة مع الطلاء السائل يسمح أسرع التجدد ، وهو أمر مهم للتجارب التي تنطوي على الظواهر العابرة ، مثل [رني نهدم التجارب 9،15. بالإضافة لعدم وجود أجار أعلى يسمح لعزل محطة سهلة للimmunostaining وRT – PCR 9،15.
The authors have nothing to disclose.
معتمد من قبل جبهة الخلاص الوطني LV (IOS 1002837)
Name of the reagent | Ingredient |
PPNH4 | 1.84 mM KH2PO4 3.4 mM Ca(NO3)2 1 mM MgSO4 2.72 mM Diammonium tartrate 54 μM FeSO4.7H2O 9.93 μM H3BO3 1.97 μM MnCl2.4H2O 0.23 μM CoCl2.6H2O 0.19 μM ZnSO4. 7H2O 0.22 μM CuSO4. 5H2O 0.10 μM Na2MoO4.2H2O 0.168 μM KI Add 0.7% agar for solid medium. |
PRM-B | PPNH4 with 6% mannitol and 0.8% agar. Add 10 mL 1M CaCl2 to 1 L before pouring plates. |
PRM-T | PPNH4 with 6% mannitol and 0.6% agar. Add 0.5 mL 1M CaCl2 to 50 mL before use. |
Liquid Plating Medium | PPNH4 with 8.5% mannitol without agar. Add 0.5 mL 1M CaCl2 to 50 mL before use. |
2% Driselase | Add 4 g of Driselase (Sigma D9515-25G) to 200 mL of 8% mannitol. Stir gently for 30 min. at room temperature, incubate 30 min. at 4°C, and stir gently for 5 min. at room temperature. Spin 2,500 g for 10 min, discard pellet. Filter with 0.22 μm, and store frozen as 10 mL aliquots. Thaw in a room temperature water bath before use. |
MMg | 0.4 M mannitol 15 mM MgCl2 4 mM MES (pH 5.7) |
PEG/Ca | 4 g PEG4000 3 mL H2O 2.5 mL 0.8 M mannitol 1 mL 1M CaCl2 |
W5 | 154 mM NaCl 125 mM CaCl2 5 mM KCl 2 mM MES (pH 5.7) |