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Biology

高效的聚乙二醇(PEG)介导的转化苔小立碗藓 doi: 10.3791/2560 Published: April 19, 2011

Summary

一个简单而有效的方法来改造

Abstract

Protocol

1。使原生质体

  1. 加入9 mL的8%甘露醇培养皿。
  2. 使用压舌板,放2-3 PPNH4板5 - 7天的老苔培养皿中含有甘露醇。
  3. 加入3毫升2%Driselase D9515 - 25G(Sigma公司)的培养皿中。
  4. 轻轻摇晃1小时的培养皿中,在室温下孵育。
  5. 原生质体悬浮液过滤器通过一个100微米的目(屋宇署猎鹰352350)。
  6. 旋转250克5分钟,过滤悬浮。去除上清。
  7. 重悬原生质体轻轻8%甘露醇500μL。
  8. 加入9.5 mL的培养管的8%甘露醇。确保原生质体是完全暂停。
  9. 重复过滤和再悬浮的步骤(1.6,1.7和1.8)两次。
  10. 取10μL的原生质体解决方案,并在一个血球计数原生质体。
  11. 10,000乘以原生质体在一个16平方米的面积获得每毫升的原生质体的数量(见图1)。

2。转型

  1. 原生质体悬浮液旋转250克5分钟。去除上清。
  2. 再暂停160万原生质体/ ml的浓度在MMG的解决方案的原生质体。
  3. 原生质体悬浮液在室温下孵育20分钟。
  4. 600原生质体悬浮液加入含有60微克的DNA成为一种文化管。轻轻涡流管。
  5. 原生质体/ DNA混合物中加入700μLPEG / CA解决方案。管轻轻摇动,直到整个混合物均匀。
  6. 在室温下孵育30分钟的混合物。
  7. 在此等待期间,用玻璃纸覆盖PRM - B板(80毫米直径的圆圈,AA包装有限公司,英国);玻璃纸水合物板面允许至少5分钟。
  8. 用抹刀,删除任何空气被困玻璃纸和板块之间的气泡。
  9. W5的解决方案与3毫升稀释的混合物。
  10. 旋转250克5分钟的混合物。去除上清。
  11. 在融化的PRM - T的2毫升重新暂停原生质体(将它添加到该解决方案可以保持在42 ° C的液体原生质体之前,)。板1毫升每玻璃纸覆盖的PRM - B板重新挂起原生质体。包装板微孔(3M公司,保健)。在生长室中,保持在25 ° C的板。
  12. 此外,原生质体可重新悬浮于1毫升液体电镀液和电镀0.5毫升用玻璃纸覆盖了PRM - B板。这将允许更快的再生,但再生植物的数量较低。
  13. 生长室设置了16小时。光照和8小时。暗周期。
  14. 移动到4天,改造后的新鲜选择板的玻璃纸。

3。代表性的成果:

转型的一个例子是如图2所示。在这个例子中使用的DNA是一个超螺旋的7.8 kb的质粒携带潮霉素抗性卡带。镀原生质体的数量减少到50%摄影。照片拍摄两周后,被转移到植物的选择板。转化效率是不影响DNA浓度高达60微克。高浓度的DNA转化效率是不利的。数据表明,该方法提供了较广泛的DNA金额一致的结果。这种方法也可以产生稳定的转化,有效,如表1所示,我们可以得到约4%微克的线性DNA,这是远远比以前 14报道的稳定转化。

我们还测试了一个超螺旋质粒携带一个荧光蛋白作为标记基因转化的热休克转化效率的影响。热休克进行了室温孵育10分钟后(在步骤2.6)在45 ° C为3分钟的水浴孵育混合物。混合物在室温水浴孵育后立即热休克17分钟。结果改造后的22个小时。获得的转化和未经热休克的比率非常相似(〜25%),但我们观察到原生质体(数据未显示)的可行性热休克的不利影响。

图1
图1。血球原生质体 ,原生质体计数所需的部分是由一个红色正方形表示。注意计数原生质体(见1.11)所需的16个广场;的图像显示了24原生质体数(24万细胞/ mL)。

图2
图2。 18日龄的瞬态转化的图片。原生质体转运形成超螺旋质粒表示。答:15μg; B:30μg,C:60μg,D:120μg。

DNA的量(微克) 效率(tranformants /微克DNA)
15,超螺旋质粒 120 ± 24
30,超螺旋质粒 145 ± 54
60,超螺旋质粒 121 ± 60
120,超螺旋质粒 71 ± 38
60,线性质粒 4 ± 1

表1:在不同的DNA量的转化效率。

Discussion

这里介绍的方法可以直接和一致的DNA转化成小立碗藓原生质体。该方法最初用于拟南芥 1,但在这里,我们表明,它执行与小立碗藓 ,一个简单的和不同的植物原生质体。因此,这种方法可以应用到其他植物物种,稍作修改。优化的可能的修改包括原生质体的浓度在MMG,MMG和PEG / CA解决方案的孵化时间。我们选择在我们日常的实验中使用60微克的DNA,因为转化与DNA浓度呈线性增加,直到这一点(见表1)。我们可以得到约7000瞬态转化一个单一的60微克DNA转化,这为进一步筛选和分析人口众多的植物,或200个稳定转化。

转化原生质体可以是液体电镀中等或PRM - T的蔓延。虽然再生效率较低时使用液体电镀液中,我们选择这种方法时,原生质体与超螺旋质粒转化。如表1显示,超螺旋质粒DNA的转换生成更多的转化,因此,我们仍然可以用液体电镀液中获得大量的植物。此外,传播与液体电镀液的原生质体,允许更快的再生,这是非常重要的实验涉及瞬态的表型,如RNA 干扰 ,击倒实验9,15的。此外,高层琼脂的情况下允许免疫组化和RT - PCR检测9,15容易植物隔离。

Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

LV是支持由美国国家科学基金会(内部监督办公室1002837)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PPNH4 1.84 mM KH2PO4
3.4 mM Ca(NO3)2
1 mM MgSO4
2.72 mM Diammonium tartrate
54 μM FeSO4.7H2O
9.93 μM H3BO3
1.97 μM MnCl2.4H2O
0.23 μM CoCl2.6H2O
0.19 μM ZnSO4. 7H2O
0.22 μM CuSO4. 5H2O
0.10 μM Na2MoO4.2H2O
0.168 μM KI
Add 0.7% agar for solid medium.
PRM-B PPNH4 with 6% mannitol and 0.8% agar. Add 10 mL 1M CaCl2 to 1 L before pouring plates.
PRM-T PPNH4 with 6% mannitol and 0.6% agar. Add 0.5 mL 1M CaCl2 to 50 mL before use.
Liquid Plating Medium PPNH4 with 8.5% mannitol without agar. Add 0.5 mL 1M CaCl2 to 50 mL before use.
2% Driselase Add 4 g of Driselase (Sigma D9515-25G) to 200 mL of 8% mannitol. Stir gently for 30 min. at room temperature, incubate 30 min. at 4°C, and stir gently for 5 min. at room temperature. Spin 2,500 g for 10 min, discard pellet. Filter with 0.22 μm, and store frozen as 10 mL aliquots. Thaw in a room temperature water bath before use.
MMg 0.4 M mannitol
15 mM MgCl2
4 mM MES (pH 5.7)
PEG/Ca 4 g PEG4000
3 mL H2O
2.5 mL 0.8 M mannitol
1 mL 1M CaCl2
W5 154 mM NaCl
125 mM CaCl2
5 mM KCl
2 mM MES (pH 5.7)

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References

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高效的聚乙二醇(PEG)介导的转化苔<em>小立碗藓</em
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Liu, Y., Vidali, L. Efficient Polyethylene Glycol (PEG) Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens. J. Vis. Exp. (50), e2560, doi:10.3791/2560 (2011).More

Liu, Y., Vidali, L. Efficient Polyethylene Glycol (PEG) Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens. J. Vis. Exp. (50), e2560, doi:10.3791/2560 (2011).

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