פוליאתילן גליקול יעיל (PEG) מתווכת טרנספורמציה של מוס Physcomitrella patens</em
Summary
שיטה פשוטה ויעילה להפוך<em> Physcomitrella pantens</em> Protoplasts מתואר. שיטה זו מותאמת פרוטוקולים<em> Physocmitrella</em> Protonemal protoplast ו<em> ארבידופסיס</em> Protoplast mesophyll שינוי<sup> 1</sup>.
Abstract
<p class="jove_content"> שיטה פשוטה ויעילה להפוך<em> Physcomitrella pantens</em> Protoplasts מתואר. שיטה זו מותאמת פרוטוקולים<em> Physocmitrella</em> Protonemal protoplast ו<em> ארבידופסיס</em> Protoplast mesophyll שינוי<sup> 1</sup>. בשל יכולתו לעבור mitotic יעיל הומולוגיים רקומבינציה<em>, Physcomitrella patens</em> התפתחה כמערכת מודל חשוב בשנים האחרונות<sup> 2</sup>. יכולת זו מאפשרת תדרים גבוהים של גן מיקוד<sup> 3-9</sup>, אשר לא בא לידי ביטוי במודל צמחים אחרים כגון<em> ארבידופסיס</em>. כדי לנצל את מלוא היתרונות של מערכת זו, אנו צריכים שיטה יעילה וקלה להעביר דנ"א לתוך התאים אזוב. הדרכים הנפוצות ביותר להפוך את זה אזוב הם הפצצה החלקיקים<sup> 10</sup> ו – PEG בתיווך DNA ספיגת<sup> 11</sup>. למרות ההפצצות החלקיקים יכול לייצר שינוי יעילות גבוהה<sup> 12</sup>, אקדחים הגן אינם זמינים למעבדות רבות הפרוטוקול קשה לתקנן. מצד שני, השינוי PEG בתיווך אינה דורשת ציוד מיוחד, והוא יכול להתבצע במעבדה כלשהי עם ברדס סטרילית. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה ויעילה מאוד עבור שינוי של protoplasts אזוב. שיטה זו יכולה לייצר יותר מ 120 transformants חולף לכל מיקרוגרם של ה-DNA, אשר מהווה שיפור של פרוטוקול היעילה ביותר שדווח קודם לכן<sup> 13</sup>. בשל יעילותה, פשטות, שחזור, שיטה זו ניתן ליישם פרויקטים הדורשים מספר רב של transformants כמו גם שינוי השגרה.</p
Protocol
1. ביצוע Protoplasts הוסף 9 מ"ל של 8% מניטול כדי בצלחת פטרי. בעזרת מרית, את האזוב בן 7 יום 2-3 PPNH4 צלחות של 5 – ב mannitol את צלחת פטרי המכילה. הוסף 3 מ"ל של Driselase 2% (Sigma D9515-25 גרם) כדי בצלחת פטרי. דגירה צלחת פטרי בטמפרטורת החדר עם עדין רועדת במשך שעה 1. סנן את ההשעיה protoplast באמצעות רשת של 100 מיקרומטר (BD פלקון 352,350). ספין ההשעיה מסוננים על 250 גרם במשך 5 דקות. הסר את supernatant. Re-להשעות את protoplasts בעדינות עם μL 500 mannitol של 8%. הוסף 9.5 מ"ל mannitol 8% בצינור תרבות. ודא protoplasts תלויים לגמרי. חזור על סינון מחדש ההשעיה צעדים (1.6, 1.7 ו -1.8) פעמיים נוספות. קח 10 μL הפתרון protoplast ולספור את protoplasts ב hemocytometer. הכפל את מספר protoplast באזור 16 מרובע על ידי 10,000 להשיג את מספר protoplasts לכל מ"ל (ראו תרשים 1). 2. טרנספורמציה ספין ההשעיה protoplast ב 250 גר 'במשך 5 דקות. הסר את supernatant. Re-להשעות protoplasts בפתרון MMg בריכוז של 1.6 מיליון protoplasts / mL. לדגור על השעיית protoplast בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. הוספת 600 μL ההשעיה protoplast לתוך צינור תרבות המכיל 60 מיקרוגרם DNA. מערבולת הצינור בעדינות. הוספת 700 μL של פתרון PEG / Ca לתוך תערובת protoplast / הדנ"א. מערבולת הצינור בעדינות עד לקבלת תערובת הומוגנית כולה. דגירה את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. במהלך תקופה זו המתנה, לכסות פ.ר.מ.-B צלחות עם צלופן (80 עיגולים בקוטר מ"מ, א.א. אריזות בע"מ, בריטניה); לאפשר צלופן כדי מימה על פני צלחת דקות לפחות 5. בעזרת מרית, להסיר בועות אוויר שנלכדו בין צלופן ואת צלחת. לדלל את התערובת עם 3 מ"ל של תמיסת W5. ספין את התערובת על 250 גרם במשך 5 דקות. הסר את supernatant. Re-להשעות protoplasts ב 2 מ"ל נמס של פ.ר.מ.-T (לפני הוספתו protoplasts הפתרון הזה אפשר לשמור נוזלי 42 ° C). צלחת של 1 מ"ל מחדש להשעות protoplasts לכל צלחת פ.ר.מ.-B מכוסה בצלופן. לעטוף את הצלחות עם micropore (3M, בריאות). שמור על צלחות של 25 מעלות צלזיוס בתא הגידול. לחלופין, ניתן protoplasts מחדש תלויה מ"ל 1 של המדיום ציפוי נוזלי מ"ל מצופה 0.5 בצלחת פ.ר.מ.-B מכוסה בצלופן. זה מאפשר התחדשות מהירה, אך מספר צמחים התחדשות נמוך. תא צמיחה מוגדר עבור 16 שעות. אור 8 שעות. מחזור כהה. הזז את הצלופן על הצלחת מבחר טרי 4 ימים לאחר השינוי. 3. נציג תוצאות: דוגמה לשינוי מוצג באיור 2. ה-DNA נעשה שימוש בדוגמה זו היתה supercoiled 7.8 kb פלסמיד שנשא קלטת עמידים hygromycin. כמות protoplasts מצופה הופחת ל -50% עבור הצילום. התמונות צולמו כשבועיים לאחר הצמחים הועברו צלחות הבחירה. יעילות השינוי אינו מושפע ריכוז ה-DNA של עד 60 מיקרוגרם. ריכוזים גבוהים יותר של ה-DNA משפיעים לרעה על יעילות הטרנספורמציה. הנתונים הראו כי שיטה זו מספקת תוצאה עקבית לאורך טווח רחב של כמות ה-DNA. שיטה זו יכולה גם ליצור transformants יציב ביעילות כפי שמוצג בטבלה 1, אנו יכולים לקבל על 4 transformants יציב לכל מיקרוגרם של ה-DNA לינארית, אשר הוא הרבה יותר גבוה ממה שדווח קודם לכן 14. כמו כן, אנו נבחן את ההשפעה של הלם החום על יעילות הטרנספורמציה ידי הפיכת פלסמיד supercoiled נושאת גן חלבון פלואורסצנטי כסמן. הלם החום בוצע 10 דקות לאחר הדגרה בטמפרטורת החדר (בתוך שלב 2.6) על ידי דוגרים את התערובת באמבט מים C ° 45 במשך 3 דקות. התערובת הודגר בתוך אמבט מים בטמפרטורת החדר מיד לאחר הלם החום 17 דקות. תוצאות נרשמו 22 שעות לאחר השינוי. יחס transformants שהושגו עם או בלי הלם החום היו דומים מאוד (~ 25%), אך ראינו השפעה שלילית של הלם החום על הכדאיות של protoplasts (מידע לא מוצג). באיור 1. מבט protoplasts ב hemocytometer. החלק הדרוש ספירת protoplast הוא הצביע על ידי ריבוע אדום. הערה 16 ריבועים נדרש לספור protoplasts (ראה 1.11); התמונה מראה ספירה של 24 protoplasts (240,000 תאים / מ"ל). איור 2. תמונות של 18 יום transformants בן חלוף. Protoplasts היו טרנסנוצר עם כמות המצוין של פלסמיד supercoiled. ת: 15μg; B: 30μg: C: 60μg; D: 120μg. כמות ה-DNA (מיקרוגרם) יעילות (tranformants / DNA מיקרוגרם) 15, supercoiled פלסמיד 120 ± 24 30, supercoiled פלסמיד 145 ± 54 60, supercoiled פלסמיד 121 ± 60 120, supercoiled פלסמיד 71 ± 38 60, לינארית פלסמיד 4 ± 1 1. טבלת טרנספורמציה יעילות בסכומים DNA שונים.
Discussion
השיטה המוצגת כאן מאפשרת שינוי ה-DNA פשוטה ועקבית לתוך protoplasts Physcomitrella patens. שיטה זו פותחה במקור עבור ארבידופסיס 1, אבל כאן הוכיחה כי היא מבצעת היטב עם protoplasts של Physcomitrella patens, צמח פשוט שונה. לכן, בשיטה זו ניתן להחיל על מיני צמחים אחרים עם שינויים קלים. שינויים אפשריים אופטימיזציה כוללים ריכוז protoplast ב MMg, זמן הדגירה בפתרון MMg PEG ו / Ca. אנו בוחרים להשתמש DNA 60 מיקרוגרם בניסויים שגרתית שלנו, כי מספר transformants מגדילה באופן ליניארי עם ריכוז ה-DNA עד לנקודה זו (טבלה 1). אנחנו יכולים לקבל כ 7000 transformants חולף או 200 transformants יציב על מהפך 60 מיקרוגרם אחד DNA, המאפשר הקרנת ניתוח נוסף של אוכלוסייה גדולה של צמחים.
Protoplasts טרנספורמציה יכול להיות או להפיץ בינוני עם ציפוי נוזלי או פ.ר.מ.-T. למרות היעילות התחדשות נמוך כאשר בינוני ציפוי נוזלי משמש, אנו בוחרים בשיטה זו כאשר protoplasts הפכו עם פלסמידים supercoiled. ככל הראה בטבלה 1, טרנספורמציות לעשות עם ה-DNA פלסמיד supercoiled ליצור transformants רבים יותר וכך, אנחנו עדיין יכולים להשיג מספר גדול של צמחים עם בינוני ציפוי נוזלי. יתר על כן, הפצת protoplasts בינוני עם ציפוי נוזלי מאפשר התחדשות מהירה, וזה חשוב עבור ניסויים הקשורים פנוטיפים חולף, כמו RNAi להפיל ניסויים 9,15. בנוסף העדר אגר העליון מאפשר בידוד צמח קל immunostaining ו RT-PCR 9,15.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LV נתמך על ידי ה-NSF (IOS 1002837)
Materials
| Name of the reagent | Ingredient |
| PPNH4 | 1.84 mM KH2PO4 3.4 mM Ca(NO3)2 1 mM MgSO4 2.72 mM Diammonium tartrate 54 μM FeSO4.7H2O 9.93 μM H3BO3 1.97 μM MnCl2.4H2O 0.23 μM CoCl2.6H2O 0.19 μM ZnSO4. 7H2O 0.22 μM CuSO4. 5H2O 0.10 μM Na2MoO4.2H2O 0.168 μM KI Add 0.7% agar for solid medium. |
| PRM-B | PPNH4 with 6% mannitol and 0.8% agar. Add 10 mL 1M CaCl2 to 1 L before pouring plates. |
| PRM-T | PPNH4 with 6% mannitol and 0.6% agar. Add 0.5 mL 1M CaCl2 to 50 mL before use. |
| Liquid Plating Medium | PPNH4 with 8.5% mannitol without agar. Add 0.5 mL 1M CaCl2 to 50 mL before use. |
| 2% Driselase | Add 4 g of Driselase (Sigma D9515-25G) to 200 mL of 8% mannitol. Stir gently for 30 min. at room temperature, incubate 30 min. at 4°C, and stir gently for 5 min. at room temperature. Spin 2,500 g for 10 min, discard pellet. Filter with 0.22 μm, and store frozen as 10 mL aliquots. Thaw in a room temperature water bath before use. |
| MMg | 0.4 M mannitol 15 mM MgCl2 4 mM MES (pH 5.7) |
| PEG/Ca | 4 g PEG4000 3 mL H2O 2.5 mL 0.8 M mannitol 1 mL 1M CaCl2 |
| W5 | 154 mM NaCl 125 mM CaCl2 5 mM KCl 2 mM MES (pH 5.7) |
References
- Abel, S., Theologis, T. Transient transformation of Arabidopsis leaf protoplasts: a versatile experimental system to study gene expression. Plant J. 5, 421-427 (1994).
- Wood, A. J., Oliver, M. J., Cove, D. J. Bryophytes as model systems. Bryologist. 103, 128-133 (2000).
- Schaefer, D. G., Zrÿd, J. -. P. Efficient gene targeting in the moss Physcomitrella patens. Plant J. 11, 1195-1206 (1997).
- Schaefer, D. G. Gene targeting in Physcomitrella patens. Curr. Opin. Plant Biol. 4, 143-150 (2001).
- Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens. Nucleic Acids Res. 33, e173-e173 (2005).
- Cove, D. The moss Physcomitrella patens. Annu. Rev. Genet. 39, 339-358 (2005).
- Kamisugi, Y. The mechanism of gene targeting in Physcomitrella patens: homologous recombination, concatenation and multiple integration. Nucleic Acids Res. 34, 6205-6215 (2006).
- Vidali, L. Rapid formin-mediated actin-filament elongation is essential for polarized plant cell growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2009).
- Sawahel, W. Transfer of foreign DNA into Physcomitrella protonemal tissue by using the gene gun. Plant Mol. Biol. 10, 315-316 (1992).
- Schaefer, D. Stable transformation of the moss Physcomitrella patens. Mol. Gen. Genet. 226, 418-424 (1991).
- Cho, S. H. Particle bombardment mediated transformation and GFP expression in the moss Physcomitrella patens. Mol. Cells. 9, 14-19 (1999).
- Ashton, N. W. The bryophyte Physcomitrella patens replicates extrachromosomal transgenic elements. New Phytol. 146, 391-402 (2000).
- Hohe, A. An improved and highly standardized transformation procedure allows efficient production of single and multiple targeted gene-knockouts in a moss, Physcomitrella patens. Curr. Genet. 44, 339-347 (2004).
- Vidali, L. Profilin is essential for tip growth in the moss Physcomitrella patens. Plant Cell. 19, 3705-3722 (2007).
Cite This Article
Liu, Y., Vidali, L. Efficient Polyethylene Glycol (PEG) Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens. J. Vis. Exp. (50), e2560, doi:10.3791/2560 (2011).