変換するのは簡単かつ効率的な方法<em>ヒメツリガネゴケpantens</em>プロトプラストが記載されている。このメソッドは、のためのプロトコルから適応される<em> Physocmitrella</em> protonemalプロトプラストと<em>シロイヌナズナ</em>葉肉プロトプラスト形質転換<sup> 1</sup>。
ここで紹介する方法は、 ヒメツリガネゴケのプロトプラストへの単純で一貫性DNA形質転換が可能になります。このメソッドはもともとシロイヌナズナ 1の開発が、ここではそれがヒメツリガネゴケ 、簡単で異なる植物のプロトプラストとよく実行することが実証された。したがって、この方法は若干変更して他の植物種に適用することができます。最適化のための実行可能な変更は、MMGとPEG /カルシウム溶液中でのMMGのプロトプラストの濃度、インキュベーション時間が含まれています。形質転換体の数がこの時点(表1)までのDNA濃度に比例して増加するため、我々は、ルーチンの実験で60μgのDNAを使用することを選択。我々は、植物の大規模な人口のさらなるスクリーニングと分析ができるように、単一の60μgのDNA形質転換、上の約7000の過渡形質転換体または200安定な形質転換体を得ることができる。
変換されたプロトプラストを液体メッキ媒体またはPRM – Tで拡散することができるのどちらか。再生効率が液体メッキの培地が使用されているときに低いですがプロトプラストをスーパーコイル状のプラスミドで形質転換されたとき、我々はこの方法を選択してください。表1に示した、スーパーコイルプラスミドDNAで行う変換は、より多くの形質転換体を生成し、したがって、我々はまだ液体メッキの培地で植物の多数を得ることができます。さらに、液体メッキ培地でプロトプラストを分散するとの実験9,15をノックダウンするようなRNAiのような一時的な表現型を、関連する実験のために重要である高速な再生を可能にする。さらに、トップアガーがない場合は、免疫染色とRT – PCR 9,15のための簡単な植物を分離することができます。
The authors have nothing to disclose.
LVは、NSF(IOS 1002837)によってサポートされています
Name of the reagent | Ingredient |
PPNH4 | 1.84 mM KH2PO4 3.4 mM Ca(NO3)2 1 mM MgSO4 2.72 mM Diammonium tartrate 54 μM FeSO4.7H2O 9.93 μM H3BO3 1.97 μM MnCl2.4H2O 0.23 μM CoCl2.6H2O 0.19 μM ZnSO4. 7H2O 0.22 μM CuSO4. 5H2O 0.10 μM Na2MoO4.2H2O 0.168 μM KI Add 0.7% agar for solid medium. |
PRM-B | PPNH4 with 6% mannitol and 0.8% agar. Add 10 mL 1M CaCl2 to 1 L before pouring plates. |
PRM-T | PPNH4 with 6% mannitol and 0.6% agar. Add 0.5 mL 1M CaCl2 to 50 mL before use. |
Liquid Plating Medium | PPNH4 with 8.5% mannitol without agar. Add 0.5 mL 1M CaCl2 to 50 mL before use. |
2% Driselase | Add 4 g of Driselase (Sigma D9515-25G) to 200 mL of 8% mannitol. Stir gently for 30 min. at room temperature, incubate 30 min. at 4°C, and stir gently for 5 min. at room temperature. Spin 2,500 g for 10 min, discard pellet. Filter with 0.22 μm, and store frozen as 10 mL aliquots. Thaw in a room temperature water bath before use. |
MMg | 0.4 M mannitol 15 mM MgCl2 4 mM MES (pH 5.7) |
PEG/Ca | 4 g PEG4000 3 mL H2O 2.5 mL 0.8 M mannitol 1 mL 1M CaCl2 |
W5 | 154 mM NaCl 125 mM CaCl2 5 mM KCl 2 mM MES (pH 5.7) |