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Biology

모스의 효율적인 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 중재 변환 Physcomitrella patens doi: 10.3791/2560 Published: April 19, 2011

Summary

변환하는 간단하고 효율적인 방법

Abstract

Protocol

1. Protoplasts 만들기

  1. 페트리 접시에 mannitol 8퍼센트 9 ML을 추가합니다.
  2. 주걱을 사용하여 5로부터 2-3 PPNH4 접시에서 칠일 오래된 이끼를 넣어 - 페트리 접시가 포함된 mannitol 인치
  3. 페트리 접시에 2 % Driselase 3 ML (시그마 D9515 - 25G)을 추가합니다.
  4. 1 시간 동안 부드러운 잡고 상온에서 페트리 접시를 품어.
  5. 100 μm의 메쉬 (BD 팰컨 352350)를 통해 원형질의 현탁액을 필터링합니다.
  6. 5 분 250g에서 필터링된 정지를 스핀. 뜨는을 제거합니다.
  7. 8 % mannitol 500 μL 매우 부드럽게 protoplasts를 다시 일시 중지합니다.
  8. 문화 튜브 9.5 ML 8 % mannitol을 추가합니다. protoplasts가 완전히 정지되어 있는지 확인하십시오.
  9. 여과 다시 정지 단계 (1.6, 1.7 및 1.8) 두 번 더 반복합니다.
  10. 원형질 솔루션 10 μL를 가지고 hemocytometer에서 protoplasts을 계산합니다.
  11. (그림 1 참조) ML 당 protoplasts의 숫자를 얻기 위해 10,000의 16 광장 지역에 원형질의 수를 곱하면됩니다.

2. 변환

  1. 5 분 250g의 원형질의 정지를 스핀. 뜨는을 제거합니다.
  2. 1,600,000 protoplasts / ML의 농도에서 MMG 솔루션 protoplasts를 다시 일시 중지합니다.
  3. 20 분 상온에서 원형질의 현탁액을 품어.
  4. 60 μg의 DNA를 포함하는 문화 튜브에 원형질의 정지 600 μL를 추가합니다. 튜브 부드럽게 소용돌이.
  5. 원형질 / DNA 혼합물에 PEG / CA 솔루션을 700 μL를 추가합니다. 소용돌이는 튜브가 부드럽게 전체 혼합물은 균질 때까지.
  6. 30 분 상온에서 혼합을 품어.
  7. 이 대기 기간 동안, 셀로판과 PRM - B 접시 (80mm 직경의 원을, AA 포장 제한, 영국) 커버, 적어도 5 분 플레이트 표면에 수화 셀로판하실 수 있습니다.
  8. 주걱으로 셀로판와 플레이트 사이에 갇혀있는 공기 방울을 제거하십시오.
  9. W5 솔루션 3 ML과 혼합물을 희석.
  10. 5 분 250g의 혼합물을 스핀. 뜨는을 제거합니다.
  11. PRM - T의 녹은이 ML에서 다시 중지 protoplasts (이 솔루션은 42 ° C에서 액체 유지 수있는 protoplasts에 추가하기 전에). 플레이트 셀로판으로 덮여 PRM - B 플레이트마다 다시 중단 protoplasts 1 ML. Micropore (3M, 의료)와 접시를 넣어. 성장 챔버에서 25 ° C에서 접시 보관하십시오.
  12. 또는, protoplasts는 액체 도금 매체와 셀로판으로 덮여 PRM - B 접시에 도금 0.5 ML 1 ML에 다시 일시 중지하실 수 있습니다. 이것은 빠른 재생이 가능하지만, 재생 공장의 수가 낮습니다.
  13. 성장 챔버는 16 시간에 대해 설정됩니다. 빛 8 시간. 어두운주기.
  14. 사일 변환 후 신선한 선택 접시에에 셀로판를 이동합니다.

3. 대표 결과 :

변환의 예제는 그림 2에 표시됩니다. 이 예제에 사용되는 DNA는 hygromycin 모성 카세트를 들고 플라스미드 supercoiled 7.8 킬로바이트했다. 도금 protoplasts의 양은 사진을 50 %로 축소되었다. 사진은 식물이 선택 접시로 이동했다 2 주 후에 찍은. 변환 효율은 최대 60 μg에 DNA 농도의 영향을받지 않습니다. DNA의 높은 농도는 변화의 효율성에 해로운 있습니다. 데이터는이 방법 DNA 금액의 넓은 범위에서 일관된 결과를 제공하는 것으로 나타났다. 이 방법은 또한 효과적으로 표 1에 나타난 안정적인 transformants를 생성할 수 있으며, 우리는 이전에보고했던 14보다 훨씬 높은 선형 DNA의 마이크로 그램 당 4 안정적인 transformants에 대해받을 수 있습니다.

우리는 또한 마커로서 형광 단백질에 대한 유전자를 운반 supercoiled 플라스미드를 변환하여 변환 효율에 열 충격의 효과를 테스트. 열 충격을 3 분 동안 45 ° C 물 목욕에있는 혼합 잠복기하여 (단계 2.6 이내) 상온 보육 후 10 분 정도 진행되었습니다. 혼합물은 17 분에 대한 열 충격 후 즉시 상온의 물을 욕조에 incubated했다. 결과는 22시간 변환 이후에 기록되었다. 함께 취득 transformants 및 열 충격없이 비율은 (~ 25 %)과 매우 유사했지만 우리는 protoplasts (데이터가 표시되지 않음)의 생존 능력에 열 충격의 부정적인 효과를 관찰했다.

그림 1
그림 1. hemocytometer에서 protoplasts의보기. 원형질의 계산에 필요한 부분이 빨간색 사각형으로 표시됩니다. protoplasts를 (1.11 참조) 계산에 필요한 16 사각형을 참고하고, 이미지는 24 protoplasts의 카운트 (240000 셀 / ML)를 보여줍니다.

그림 2
그림 2. 십팔일 오래된 과도 transformants 사진. Protoplasts은 트랜스되었습니다supercoiled 플라스미드의 표시 양의 형성. A : 15μg, B : 30μg, C : 60μg, D : 120μg.

DNA (μg)의 금액 효율성 (tranformants / μg의 DNA)
15, 플라스미드 supercoiled 120 ± 24
30, 플라스미드 supercoiled 145 ± 54
60, 플라스미드 supercoiled 121 ± 60
120, 플라스미드 supercoiled 71 ± 38
60, 플라스미드 선형 4 ± 1

다양한 DNA 금액에 표 1. 변환 효율.

Discussion

여기서 제시하는 방법은 Physcomitrella patens의 protoplasts으로 간단하고 일관된 DNA 변환이 가능합니다. 이 방법은 원래 Arabidopsis 1 개발하지만, 여기는 Physcomitrella patens, 간단하고 다른 식물의 protoplasts 잘 수행하는 입증되었다. 따라서,이 방법은 약간의 수정을 다른 식물 수종에 적용할 수 있습니다. 최적화에 대한 가능성이 수정은 MMG의 원형질 농도, MMG와 PEG / 칼슘 용액에 배양 시간을 포함합니다. transformants의 숫자가이 시점 (표 1)까지 D​​NA 농도와 선형 증가하기 때문에 우리는 우리의 일상적인 실험 60 μg의 DNA를 사용하도록 선택할 수 있습니다. 우리는 식물의 대규모 인구의 추가 심사 및 분석을 위해 이용할 수있는 하나의 60 μg의 DNA 변환에 약 7,000 과도 transformants 또는 200 안정적인 transformants를 얻을 수 있습니다.

변형 protoplasts은 액체 도금 매체 또는 PRM - T와 함께 중 전염 수 있습니다. 재생 효율이 액체 도금 매체를 사용하는 경우 낮은이지만 protoplasts가 supercoiled plasmids로 변환했을 때, 우리는이 방법을 선택합니다. 마찬가지로 표 1에 보였다, supercoiled 플라스미드 DNA와 함께 한 변환은 더 많은 transformants를 생성하기 때문에, 우리는 여전히 액체 도금 매체와 식물의 큰 숫자를 얻을 수 있습니다. 또한, 액체 도금 매체와 protoplasts을 전파하는 것은 실험 9,15를 허물고 같은 RNAi과 같은 과도 phenotypes를 관련된 실험을위한 중요합니다 빠른 재생을 허용합니다. 또한 상단 한천의 부재는 immunostaining 및 RT - PCR 9,15 쉽게 공장 절연을 허용합니다.

Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

LV는 NSF (IOS 1,002,837)에 의해 지원됩니다

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PPNH4 1.84 mM KH2PO4
3.4 mM Ca(NO3)2
1 mM MgSO4
2.72 mM Diammonium tartrate
54 μM FeSO4.7H2O
9.93 μM H3BO3
1.97 μM MnCl2.4H2O
0.23 μM CoCl2.6H2O
0.19 μM ZnSO4. 7H2O
0.22 μM CuSO4. 5H2O
0.10 μM Na2MoO4.2H2O
0.168 μM KI
Add 0.7% agar for solid medium.
PRM-B PPNH4 with 6% mannitol and 0.8% agar. Add 10 mL 1M CaCl2 to 1 L before pouring plates.
PRM-T PPNH4 with 6% mannitol and 0.6% agar. Add 0.5 mL 1M CaCl2 to 50 mL before use.
Liquid Plating Medium PPNH4 with 8.5% mannitol without agar. Add 0.5 mL 1M CaCl2 to 50 mL before use.
2% Driselase Add 4 g of Driselase (Sigma D9515-25G) to 200 mL of 8% mannitol. Stir gently for 30 min. at room temperature, incubate 30 min. at 4°C, and stir gently for 5 min. at room temperature. Spin 2,500 g for 10 min, discard pellet. Filter with 0.22 μm, and store frozen as 10 mL aliquots. Thaw in a room temperature water bath before use.
MMg 0.4 M mannitol
15 mM MgCl2
4 mM MES (pH 5.7)
PEG/Ca 4 g PEG4000
3 mL H2O
2.5 mL 0.8 M mannitol
1 mL 1M CaCl2
W5 154 mM NaCl
125 mM CaCl2
5 mM KCl
2 mM MES (pH 5.7)

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References

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모스의 효율적인 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 중재 변환<em> Physcomitrella patens</em
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Liu, Y., Vidali, L. Efficient Polyethylene Glycol (PEG) Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens. J. Vis. Exp. (50), e2560, doi:10.3791/2560 (2011).More

Liu, Y., Vidali, L. Efficient Polyethylene Glycol (PEG) Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens. J. Vis. Exp. (50), e2560, doi:10.3791/2560 (2011).

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