Простой и эффективный метод для преобразования<em> Physcomitrella pantens</em> Протопластов описано. Этот метод адаптирован из протоколов<em> Physocmitrella</em> Protonemal протопластов и<em> Arabidopsis</em> Мезофильных протопластов преобразования<sup> 1</sup>.
Простой и эффективный способ превратить Physcomitrella pantens протопластов описано. Этот метод адаптирован из протоколов для Physocmitrella protonemal протопласта и Arabidopsis трансформация протопластов мезофилла 1. Из-за его способности пройти эффективный митотической гомологичной рекомбинации, Physcomitrella patens стала важной модельной системой в последние годы 2. Эта способность позволяет высоких частот генов таргетинга 3-9, которые не видели в других растениях, таких как модель Arabidopsis. Чтобы воспользоваться всеми преимуществами этой системы, нам нужна эффективная и простой метод доставки ДНК в клетки мха. Наиболее распространенные способы, чтобы преобразовать эту мох бомбардировки частицами 10 и PEG-опосредованного поглощения ДНК 11. Хотя бомбардировки частицами может привести к высокой эффективности преобразования 12, ген пушки не доступны для многих лабораторий и протокол трудно стандартизировать. С другой стороны, ПЭГ опосредованной трансформации не требует специализированного оборудования, и может быть выполнена в любой лаборатории со стерильной капотом. Здесь мы покажем, простой и очень эффективный метод для трансформации протопластов мха. Этот метод может генерировать более 120 переходных трансформантов на микрограмм ДНК, что является улучшением по сравнению с наиболее эффективный протокол сообщалось ранее 13. Из-за своей простоты, эффективности и воспроизводимости, этот метод может быть применен к проектов, требующих большого числа трансформантов, а также для рутинных преобразований.
Метод позволяет представленные здесь просты и последовательны ДНК превращение в Physcomitrella протопластов patens. Этот метод был первоначально разработан для Arabidopsis 1, но здесь мы продемонстрировали, что он хорошо работает с протопластов Physcomitrella patens, проще и различные растения. Поэтому этот метод может быть применен к другим видам растений с незначительными изменениями. Возможные изменения для оптимизации включают протопластов концентрация в ММГ, время инкубации в растворе ММГ и PEG / Ca. Мы решили использовать 60 мкг ДНК в наших рутинных экспериментов, так как количество трансформантов линейно возрастает с концентрацией ДНК до этого момента (табл. 1). Мы могли бы получить примерно 7000 трансформантов переходных или 200 стабильных трансформантов на одном 60 мкг ДНК трансформации, что позволяет для дальнейшего обследования и анализа большого числа растений.
Преобразовано протопластов может быть либо распространяются с жидкой средой покрытие или PRM-T. Хотя эффективность регенерации ниже при жидкой среде покрытия используется, мы выбираем этот метод, когда протопластов были преобразованы с суперспиральной плазмид. Как показали в таблице 1, преобразования сделано с суперспиральной плазмидной ДНК генерировать много трансформантов и, таким образом, мы можем получить большое количество растений с жидкой средой обшивки. Кроме того, распространение протопластов с жидкой средой покрытие позволяет ускорить регенерацию, что очень важно для экспериментов с участием переходных фенотипов, таких как RNAi сбить экспериментов 9,15. Кроме того отсутствие верхней агар позволяет легко изоляции завод по иммунной и RT-PCR 9,15.
The authors have nothing to disclose.
Л. В. поддерживается NSF (IOS 1002837)
Name of the reagent | Ingredient |
PPNH4 | 1.84 mM KH2PO4 3.4 mM Ca(NO3)2 1 mM MgSO4 2.72 mM Diammonium tartrate 54 μM FeSO4.7H2O 9.93 μM H3BO3 1.97 μM MnCl2.4H2O 0.23 μM CoCl2.6H2O 0.19 μM ZnSO4. 7H2O 0.22 μM CuSO4. 5H2O 0.10 μM Na2MoO4.2H2O 0.168 μM KI Add 0.7% agar for solid medium. |
PRM-B | PPNH4 with 6% mannitol and 0.8% agar. Add 10 mL 1M CaCl2 to 1 L before pouring plates. |
PRM-T | PPNH4 with 6% mannitol and 0.6% agar. Add 0.5 mL 1M CaCl2 to 50 mL before use. |
Liquid Plating Medium | PPNH4 with 8.5% mannitol without agar. Add 0.5 mL 1M CaCl2 to 50 mL before use. |
2% Driselase | Add 4 g of Driselase (Sigma D9515-25G) to 200 mL of 8% mannitol. Stir gently for 30 min. at room temperature, incubate 30 min. at 4°C, and stir gently for 5 min. at room temperature. Spin 2,500 g for 10 min, discard pellet. Filter with 0.22 μm, and store frozen as 10 mL aliquots. Thaw in a room temperature water bath before use. |
MMg | 0.4 M mannitol 15 mM MgCl2 4 mM MES (pH 5.7) |
PEG/Ca | 4 g PEG4000 3 mL H2O 2.5 mL 0.8 M mannitol 1 mL 1M CaCl2 |
W5 | 154 mM NaCl 125 mM CaCl2 5 mM KCl 2 mM MES (pH 5.7) |