Summary
I denna artikel beskrev vi kirurgi förfarande och hantering tips för implantation av ultratunn polyimid-baserade mikroelektrod array (PBM-array) på musen skallen för förvärv av hög densitet encephalography (EEG) i en musmodell.
Abstract
Elektroencefalogram (EEG) anger genomsnitt elektriska aktiviteten i neuronala populationer på en storskalig nivå. Det är allmänt utnyttjas som en non-invasiv hjärna uppföljningsverktyg inom kognitiv neurovetenskap samt ett diagnostiskt verktyg för epilepsi och sömnstörningar i neurologi. Men den underliggande mekanismen vid EEG-rytm generationen fortfarande under slöjan. Nyligen introducerade polyimid-baserade mikroelektrod (PBM-array) för högupplösta mus EEG-1 är ett av försöken att svara på neurofysiologiska frågor om EEG-signaler bygger på en rik genetisk resurs som musen modellen innehåller för analys av komplexa EEG generationens process. Denna tillämpning av nanofabricated PBM-array mus skallen är ett effektivt verktyg för insamling av storskalig hjärnaktivitet av transgena möss och rymmer för att identifiera de neurala korrelat till vissa EEG-rytmer i samband med beteende. Men dess ultratunna tjocklek och tvåspetsnitar struktur orsaka problem i hantering och implantation av PBM-array. I den presenteras video, är förberedelse och kirurgi steg för implantation av PBM-array på en mus skallen beskrivs steg för steg. Hantering och kirurgi tips för att hjälpa forskare att lyckas i implantationen finns också.
Protocol
1. Sammanfattning
C57BL/6J - 129S4/SvJae hybrid möss (12 ~ 15 veckor) är bedövad med ketamin (120 mg / kg ip) och xylazin (6 mg / kg, ip) cocktail. Svans eller tå nypa föregår operation för att inspektera djup anestesi. Musen skall fastställas av stereotaxic apparater (David Kopf Instrument, Modell 902, Calif, USA). Hårbotten är inristade på mittlinjen ca 25 mm för att exponera skallen under lidokain behandling för smärtlindring. Skräp på skallen torkas av med salt-indränkt bomull tips för att förbättra efterlevnaden av elektroden till skallen. Den bregma och lambda punkter är markerade, och ligger i samma horisontella plan. Den polyimid baserade mikroelektrod array (PBM-array) är placerad så att den vertikala mittlinjen uppfyller mittlinjen av skallen. Den bregma punkten ska placeras i mitten av 5: e lagret av den främre av PBM-array. Två eller tre microscrews används på null utrymme i kanten av skallen för att säkra placeringen av elektrod med dentala cement. För propping den PBM-array-kontakt, position vi en strut på mitten av huvudet, och täck den med dentala cement. Efter härdning är anskäras huden sys ihop, och minst 5 dagar ges för återhämtning. Under återhämtning, är de möss inrymt i enskilda burar med fri tillgång till mat och vatten. Efter återhämtningen är EEG inspelning utförs. Djurvård, kirurgiska, och inspelning förfaranden i enlighet med riktlinjerna för den institutionella Animal skötsel och användning kommittén efter Lag 1992 av Korea Lab förordningarna Djurvård och tillhörande riktlinjer. Den PBM-arrayer i detta manuskript var fabricerade som beskrivs av Choi. et. al. 1 Vänligen kontakta författarna att använda samma PBM-array i videon.
2. Förfarande
- Förbered steriliserade kirurgiska instrument och stereotaxic apparater.
- Bedöva musen med anestesi (t.ex. ketamin / xylazin med en dos på 120 och 60 mg / kg ip, repectively). Svans eller tå nypa föregår operation för att inspektera djup anestesi.
- Montera musen på stereotaxic apparaten genom att placera örat barer i musens hörselgången och skärpa den på plats. Ögonen kan täckas med biokompatibla gelé (t ex vaselin) för att hålla ögonen från att torka upp av operationen ljuset. Efter fuktgivande musens huvud med 70% etanol, raka pälsen av dess huvud.
- Incise huvudet ca 25 mm med en hårbotten. Det är rekommendabelt att använda en liten mängd på 2% lidokain hydroklorid under hårbotten. Nyp ihop huden med mikro klämmor (Fine Science Tools (USA), Inc., 18.052-03, Calif, USA) för att hålla snittet vidöppen.
- Torka eventuellt återstående vävnad skräp på skallen med koksaltlösning-indränkt tops förbättra efterlevnaden av PBM-array till skallen. Att använda väteperoxid för att ta bort rester av membranet är också effektiv.
- Hitta bregma och lambda punkter på skallen, och markera dem med en oljebaserad tuschpenna. Placera PBM-array så att dess vertikala mittlinjen uppfyller mittlinjen av skallen som visas i figur 1. Placera bregma vid mitten av 5: e lagret av den främre av PBM-array med en droppe av kranvatten. Kompress filmen elektroden från mediala mot laterala noggrant för bättre följsamhet. För att hjälpa filmen hårdare elektroden fastnar på skallen, bör filmen elektroden vara helt torr på skallen. Filmen elektroden återstår att fastställas på skallen av van der Waals-kraft. När omplacering elektroden, är en annan droppe kranvatten som krävs för att förhindra att elektroden från att rivas.
Figur 1. (Vänster) Ett PBM-array på musen skallen. Den anterio-bakre axeln i PBM-array matchar linjen mellan bregma (BP) och lambda poäng (LP). (Rätt) Den förmodade elektroden positioner på musen hjärnan ytan. Anatomi musen segmenteras från 3-D MR digital atlas databas med en vuxen C57BL/6J mus hjärnan produceras i Brookhaven National Lab och platser elektroden är märkta enligt stereotaxic mätningen. Ground (G) och referens (Ref) elektroder är markerade i den högra figuren. - Markera minst tre positioner på den öppna delen av skallen, och sedan göra hål på dessa platser med hjälp av en Tandläkarborrmaskiner för placering av den stödjande microscrews. Dessa microscrews har en roll i stolpe och mekaniskt stöd för dentala cement på skallen. Extra försiktighet krävs under borrningen. Eftersom musen skallen består av tunna skikt, kan blödningar lätt uppstå under borrningen. När blödande händer, sluta borrning och applicera liten mängd BLODSTILLANDE pulver i hålet.
- Applicera dentala akryl cement (Vertex-Dental, Vertex Self-Härdning, Nederländerna) för att täcka PBM-array, skruvar ankare, och resten av skallen. Förbered dentala cement i en klibbig och trögflytande Condition.
- Placera en stel pinne som en strut på mitten av huvudet med ett starkt lim (t.ex. Loctite, Loctite Corp, Dublin, Irland). Sätt dubbelhäftande tejp på baksidan av kontakten planet. Manipulera PBM-array-kontakt möjlighet att ansluta med spetsen på fjäderben. Det vertikala avståndet mellan skallen och kontakten bör vara mer än 5 mm. Stick i kontakten planet och spetsen av pinnen med ett starkt lim för bättre vidhäftning.
- Se till att dentala cement är helt botad. Sedan använda dentala akryl cement över skallen och baksidan av kontakten plan för att säkra kontakten till skallen.
- Ta bort mikro klämmor. Sutur snittas huden med steriliserad sömmar fiber. Ta bort musen från apparaten. Du kan ansöka extra dentala akryl cement för att skydda utsatta skallen. Applicera ett antibiotikum (fucidin salva, Dong Wha farmaci, Sydkorea) runt cement och sys huden.
- Placera musen i en steriliserad bur tills den återfår sin ursprungliga kroppsvikt (cirka 5 till 7 dagar). Det rekommenderas att inte införa någon bur kompisar.
- Efter återhämtning, anslut musen med ett lätt kretskort (PCB) kontakt i toppen av en flerkanalig EEG-förstärkare systemet (Synamps 2, North Carolina, USA) i sin egen bur. Den anslutande linjer bör behandlas varsamt så det inte trassla.
- Efter en timmes tillvänjning, utföra registreringen. Scan 4,4. (North Carolina, USA) förvärv programvara användes i detta experiment. En typisk tidskurva uppsättning mus EEG visas i Figur 2. Det rekommenderas att logga in videon att relatera beteendet hos musen.
- Framställda signal kan analyseras med MATLAB (The MathWorks, Natick, MA, USA) för att producera den topografiska hjärnan kartan. Exempel kretsmönster i EEG makt karta över musen hjärnan visas i figur 3.
3. Representativa resultat
Om ovanstående kirurgiska ingrepp är korrekt genomförs, kommer 40 kanaler mus EEG-inspelning framgångsrikt utföras utan dåligt kanaler. Följande figurer visar den representativa råa EEG-spår och topografiska kartor.
Figur 2. Ett prov spår av EEG upplever frånvaro beslag induceras genom injektion γ-butyrolakton (GBL, 50mg/kg, IP). Röd stapel visar spike-wave och utsläpp (SWDs) under frånvaro anfall. Den horisontella och vertikala axlarna anger tid och spänning, respektive. Numret följer den kanal montage enligt figur. 1 (höger).
Figur 3. Topografiska kartor visar 2-6 Hz kraftdistribution. Värdet i colorbar representerar färgskala av makt karta. Under spike-wave och utsläpp (SWDs) induceras av γ-butyrolakton (GBL, 50mg/kg, ip), kraften i den stora frontoparietal kortikala regioner markant ökning jämfört med strömmen innan GBL injektion (Baseline).
Discussion
Här rapporterar vi kirurgiska och inspelning förfaranden för att få hög densitet EEG i fritt röra möss. Denna metod ger oss möjlighet att få funktionell hjärnavbildning kartor från musmodell för att studera molekylära mekanismer spontana rytmiska 1,2 eller händelser relaterade aktiviteter hjärnan.
Förvärv av alla kanaler i PBM-array är en nödvändig förutsättning för att få hela hjärnan kartläggning, men att göra en säker kontakt för varje kanal är mycket utmanande. För att behålla konsekvent kontakt kanalen till skallen, är följande åtgärder visat sig vara viktigt. Först av allt, kan alla vävnad skräp på skallen avskilda elektroden från skallen. Därför är det mycket viktigt att ta bort all vävnad skräp med sterilt tops och torka upp skallen ytan. För det andra är möjligheten för PBM-array som kan fastna på skallen ytan van der Waals-kraft. Det föreslås att tillämpa en droppe kranvatten på skallen för att bygga vatten lager innan en ansöka PBM-array till skallen. För det tredje är rätt viskositet dentala cement mycket viktigt. Om det är för rinnande kan det bygga upp ett isolerande skikt under PBM-array. Om det är för tätt, kommer dentala cement faller lätt isär från skallen på grund av dess egen vikt. Slutligen bör minst tre stödja microscrews implanteras på skallen för att göra dentala cement hårt bundna till skallen. Den bärande microscrews hålla upp det dentala cement och säkra headstage, vilket är avgörande för långsiktig studie.
Tillämpningen av PBM-array kommer att begränsas till kronisk studie med vuxna möss på grund av dess storlek och vikt. Baserat på vår erfarenhet, möss tyngre än 25 g är tillräckliga för att använda. Som ytterligare applikationer, genom null utrymmet mellan grenarna i vår PBM-array, kan man införa sekundära elektroder för inspelning eller stimulans syfte.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Med stöd av Kist Grant (2E21510), National Honor Scientist program för undervisningsministeriet, och den ursprungliga Technology Research Program för Brain Science genom National Research Foundation of Korea som finansieras av ministeriet för utbildning, vetenskap och teknik (2010 till 0.018.944).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| γbutyrolactone | Sigma-Aldrich | H7629-500G |
References
- Choi, J. H., Koch, K. P., Poppendieck, W., Lee, M., Shin, H. S. High resolution Electroencephalography in Freely Moving Mice. J Neurophysiol. , Forthcoming.
- Lee, M., Shin, H. S., Choi, J. H. Simultaneous recording of brain activity and functional connectivity in the mouse brain. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 2934-2936 (2009).
