Summary
В этой статье мы описали процедуру хирургии и обработки советы для имплантации ультратонкие полиимидные основе микроэлектрода массива (PBM-массива) на мыши череп на приобретение высокой плотности энцефалографии (ЭЭГ) в мышиной модели.
Abstract
Электроэнцефалограмме (ЭЭГ) показывает усредненную электрическую активность нейронов населения на крупномасштабные уровне. Он широко используется как неинвазивный инструмент мониторинга мозга в познавательной неврологии, а также диагностический инструмент для лечения эпилепсии и нарушений сна в неврологии. Тем не менее, основной механизм генерации ритма ЭЭГ-прежнему находится под вуалью. Недавно введенные полиимидной основе микроэлектрода (PBM-массив) за высокое разрешение мыши ЭЭГ 1 является одним из испытаний, чтобы ответить на вопросы о нейрофизиологических ЭЭГ сигналов на основе богатого генетического ресурса, который содержит модель мыши для анализа сложных процессов ЭЭГ поколения. Это применение nanofabricated PBM-массив для мыши череп является эффективным инструментом для сбора крупномасштабной деятельности мозга трансгенных мышей и приспосабливает для идентификации нейронных соотносится с определенным ритмов ЭЭГ в сочетании с поведением. Однако его ультратонкие толщины и раздвоенные структуры причиной неприятностей в обращении и имплантации PBM-массива. В представленном видео, подготовки и хирургии шаги для имплантации PBM-массива на череп мыши описаны шаг за шагом. Обработка и хирургии советов, которые помогут исследователям удалось имплантации также предоставляются.
Protocol
1. Резюме
C57BL/6J - 129S4/SvJae гибридных мышей (12 ~ 15 недель) анестезируют с кетамином (120 мг / кг) и ксилазина (6 мг / кг, внутрибрюшинно) коктейль. Хвост или ног щипать предшествует операция проверять глубину анестезии. Мыши фиксируется стереотаксического аппарата (David Kopf Instruments, модель 902, Калифорния, США). Скальп надрезанные по средней линии около 25 мм, чтобы выставить череп под лечение лидокаином для уменьшения боли. Любой мусора на череп стерт соленой пропитанной советы хлопка для повышения приверженности электрода к черепу. Брегмы и лямбда-точки обозначены и установить в одной горизонтальной плоскости. Полиимида основан микроэлектрода массива (PBM-массива) расположены так, что его вертикальной средней линии соответствует средней линии черепа. Точки брегмы должны быть расположены на середине 5-го слоя передней из PBM-массива. Два или три microscrews используются в нуль-пространство на краю черепа, чтобы помочь обеспечить положение электрода с зубным цементом. Для подперев PBM-массив разъем, мы позиционируем стойка на середине головы, и покрыть ее зубным цементом. После отверждения, надрезанные кожи зашивается, и как минимум 5 дней даны для восстановления. Во время восстановления, мышей размещены в отдельных клетках при свободном доступе к пище и воде. После восстановления записи ЭЭГ не выполняется. Домашние животные, уход, хирургического и записи процедур в соответствии с руководящими принципами для институциональных уходу и использованию животных Комитета после закона 1992 года Корея Лаборатория Animal Care правила и связанные с ними руководящих принципов. PBM-массивов в этой рукописи были изготовлены как описано Чой. и др.. др. 1. Пожалуйста, свяжитесь с авторами, чтобы использовать тот же PBM-массив в видео.
2. Процедура
- Подготовка стерилизовать хирургические инструменты и стереотаксического аппарата.
- Обезболить мышь с анестезией (например, кетамин / ксилазина с дозы 120 и 60 мг / кг, соответственно). Хвост или ног щипать предшествует операция проверять глубину анестезии.
- Гора мышь на стереотаксического аппарата путем размещения ухо баров в слуховой канал, мыши и ужесточения его на месте. Глаза могут быть покрыты биосовместимых желе (например, вазелин), чтобы держать глаза от высыхания путем операции света. После увлажняющий голову мыши с 70% этанола, брить шерсть от его головы.
- Надрезать головой около 25 мм с кожи головы. Это рекомендуется применять небольшое количество 2% раствора лидокаина гидрохлорида в кожу головы. Сожмите кожу микро зажимов (Fine Инструменты науки (США), Inc, 18052-03, Калифорния, США), чтобы разрез широко открыты.
- Протрите все оставшиеся ткани мусора на череп с солевым пропитанной ватные тампоны повышения приверженности PBM-массив для черепа. Использование перекиси для удаления остатков мембрана также эффективны.
- Найти брегмы и лямбда-точек на черепе, и пометить их на масляной основе маркером. Место PBM-массива, чтобы его вертикальной средней линии соответствует средней линии черепа, как показано на рисунке 1. Позиция брегмы в середине 5-й слой переднего из PBM-массив с одной капли водопроводной воды. Тампон пленочного электрода от медиальной к боковым внимательно для лучшего присоединения. В целях оказания помощи палки пленочного электрода жесткие к черепу, фильм электрод должен быть полностью сухим на черепе. Фильм электрод остается фиксированной на черепе ван-дер-Ваальса силы. При повторной позиционирования электрода, еще одну каплю водопроводной воды необходимо для предотвращения электрода от разрывается.
Рисунок 1. (Слева) PBM-массива на мышь черепа. Anterio-задней оси PBM-массив матчей линии между брегмы (BP) и лямбда-точки (LP). (Правый) предполагаемые позиции электрода на поверхности мозга мыши. Анатомию мыши сегментированы от 3-D МРТ цифровой атлас база взрослой мыши C57BL/6J мозга производится в Брукхейвенской национальной лаборатории и электродом места обозначены в соответствии с стереотаксической измерения. Земля (G) и ссылка (Ref) Электроды отмечены на рисунке справа. - Марка по крайней мере три позиции на открытой площадке черепа, а затем сделать отверстия в тех местах, используя бормашины для позиционирования поддержки microscrews. Эти microscrews есть роль стойкой и механически поддерживать стоматологического цемента на черепе. Дополнительные необходимо проявлять осторожность во время бурения. Поскольку мышь череп состоит из тонких слоев, кровотечение может возникнуть легко в процессе бурения. Если кровотечение происходит, остановить бурение и применить небольшое количество гемостатических порошок в отверстие.
- Применение стоматологического цемента акриловые (Vertex-Dental, Vertex Self-отверждения, Нидерланды), чтобы покрыть PBM-массив, анкерные болты, а остальные черепа. Подготовка стоматологического цемента в с клейкая и вязкаяondition.
- Позиция жесткая палка, как стойка на середине головки с помощью сильного клея (например, Loctite, Henkel Loctite Corp, Дублин, Ирландия). Положите двусторонней клейкой ленты на задней плоскости разъема. Манипулирование PBM-массив разъем позицию, чтобы соединиться с кончика стойки. Вертикальное расстояние между черепом и разъем должны быть более чем на 5 мм. Придерживайтесь плоскости разъема и кончик палки использования сильного клея для лучшего сцепления.
- Убедитесь, что зубной цемент полностью вылечить. Затем нанесите стоматологических акриловых цемента над черепом и задней плоскости разъема для фиксации разъема к черепу.
- Удалить микро зажимов. Шовный надрезанные кожу стерилизовать сшивания волокон. Удалить мышь от аппарата. Вы можете подать дополнительное стоматологического цемента акриловые, чтобы оградить подвергается черепа. Применение антибиотиков (fucidin мазь, Dong Wha фармации, Южная Корея) около цемента и зашивается кожи.
- Наведите в стерилизованные клетке, пока она восстанавливает свой первоначальный вес тела (приблизительно от 5 до 7 дней). Рекомендуется не вводить клетки товарищей.
- После восстановления подключения мыши, легкий печатной платы (PCB) разъем для напорного ящика многоканальной ЭЭГ системы усилителя (Synamps 2, Северная Каролина, США) в своей собственной клетке. Соединительных линий следует относиться осторожно, чтобы не запутаться.
- Через 1 час привыкания, выполнять записи ЭЭГ. Scan 4.4. (Северная Каролина, США), приобретение программного обеспечения была использована в данном эксперименте. Типичный набор следов время мыши ЭЭГ показано на рисунке 2. Рекомендуется для входа видео связать поведение мыши.
- Полученный сигнал может быть проанализирован MATLAB (MathWorks, Натик, штат Массачусетс, США), чтобы произвести топографическую карту мозга. Пример топологии ЭЭГ карте сила мозга мыши, показаны на рисунке 3.
3. Представитель Результаты
Если выше хирургические процедуры правильно проводятся, 40 каналов мыши ЭЭГ будет успешно выполняться без плохих каналах. После цифры показывают, представитель сырых ЭЭГ следы и топографических карт.
Рисунок 2. Образцы следов ЭЭГ переживают отсутствие захвата индуцированных путем инъекции γ-бутиролактон (ГБЛ, 50mg/kg, IP). Красная полоса указывает на спайк-волна и сбросов (СТО) во время отсутствия захвата. Горизонтальной и вертикальной осей указывают время и напряжения, соответственно. Следует номер канала монтаж показано на рис. 1 (справа).
Рисунок 3. Топографических картах показывают 2-6 Гц распределения электроэнергии. Значение в colorbar представляет цветовую гамму власти карте. Во время спайк-волна и сбросов (СТО), индуцированного γ-бутиролактон (ГБЛ, 50mg/kg, ф), власть в большом лобно-теменной областях коры значительно больше по сравнению с мощностью до ГБЛ инъекций (Baseline).
Discussion
Здесь мы сообщаем о хирургическом и регистрации приобретать высокой плотности ЭЭГ в свободно движущихся мышей. Этот метод позволяет получить функциональные карты мозга от мышей модель для изучения молекулярных механизмов спонтанной ритмической 1,2 или события, связанного деятельности мозга.
Приобретение всех каналов в PBM-массив является необходимым условием для получения целого отображение мозг, однако сделать безопасный контакт для каждого канала является весьма сложной задачей. Чтобы поддерживать плотный контакт канала к черепу, следующие процедуры оказываются важными. Прежде всего, любой ткани мусора на черепе может отделить электрод от черепа. Поэтому очень важно, чтобы удалить все остатки ткани с стерилизовать ватные тампоны и засыхают поверхности черепа. Во-вторых, способность PBM-массив, который может придерживаться поверхности черепа является ван-дер-Ваальса. Предлагается применять капли водопроводной воды на черепе построить водный слой прежде чем применять PBM-массив для черепа. В-третьих, право вязкость стоматологического цемента является очень важным. Если он слишком жидкий, он может построить изоляционный слой под PBM-массива. Если она слишком плотная, стоматологического цемента будет легко развалиться из черепа из-за его собственного веса. Наконец, по крайней мере тремя опорными microscrews следует имплантировать на черепе, чтобы сделать стоматологического цемента тесно связан с черепом. Поддержка microscrews задержать стоматологического цемента и безопасной headstage, что очень важно для долгосрочного исследования.
Применение PBM-массив будет ограничен хроническим исследования с взрослых мышей из-за его размера и веса. Основываясь на нашем опыте, мышей тяжелее 25 г достаточно для использования. В качестве дополнительного приложения, через нуль-пространство между ветвями в нашей PBM-массив, можно ввести вторичные электроды для записи или стимуляции цели.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Поддержка KIST Грант (2E21510), национальной чести ученого программе Министерства образования и оригинальных программ исследований технологии для наук о мозге через Национального исследовательского фонда Корея финансируемый Министерством образования, науки и техники (2010-0018944).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| γbutyrolactone | Sigma-Aldrich | H7629-500G |
References
- Choi, J. H., Koch, K. P., Poppendieck, W., Lee, M., Shin, H. S. High resolution Electroencephalography in Freely Moving Mice. J Neurophysiol. , Forthcoming.
- Lee, M., Shin, H. S., Choi, J. H. Simultaneous recording of brain activity and functional connectivity in the mouse brain. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 2934-2936 (2009).
