Органотипической мозжечка культур: проблемы и апоптоза Обнаружение

Summary

Этот метод описывает генерацию органотипической мозжечка культур и действие определенных апоптоза стимулов на жизнеспособность различных типов клеток мозжечка.

Abstract

Органотипической культурах нейронов ткани были впервые введены в 1947 году Hogue ^1,2 и составили значительный прорыв в области нейронауки. С тех пор техника получила дальнейшее развитие и в настоящее время Есть много различных способов подготовить органотипической культур. Метод, представленный здесь было приспособлено от того, описывается Stoppini и соавт. Для подготовки ломтиками и от Gogolla и соавт. Для окрашивания процедура ^3,4.

Уникальная особенность этого метода является то, что он позволяет изучать различные части мозга, таких как гиппокамп и мозжечок в их первоначальную структуру, обеспечивая большое преимущество перед диссоциированных культурах, в котором все клеточной организации и нейронных сетей нарушена. В случае мозжечка это даже более выгодно, поскольку позволяет изучать клеток Пуркинье, чрезвычайно трудно получить как диссоциированных первичной культуре. Этот метод может быть использован для изучения некоторых особенностей развития мозжечка в пробирке, а также для электрофизиологических и фармакологических экспериментов в обоих дикого типа и мутантных мышей.

Описанный здесь метод был разработан для изучения влияния апоптоза стимулы, такие как Fas лиганда в развивающихся мозжечка, используя TUNEL окрашивания для измерения апоптоз клеток. Если TUNEL окрашивания в сочетании с типом клеток специфических маркеров, таких как кальбиндин для клеток Пуркинье, можно оценить гибель клеток в популяции клеток, определенным образом. Окрашивание кальбиндин также служит для оценки качества мозжечка культур.

Protocol

1. Органотипической мозжечка культур: Чтобы успешно генерировать органотипической мозжечка культуры используют мышей между P0-P3 или P8-P12. Для нашего эксперимента мы использовали мышей в P8-P12 диапазона, поскольку эта стадия развития является более приемлемым для нашего исследования. Подготовка вскрытие и культуральной среде: Рассечение мозга и нарезать подготовке проводятся в странах с низким натрия Искусственный спинномозговой жидкости (ACSF), содержащего 1 мМ хлорида кальция, 10мм D-глюкозы, 4мм хлорид калия, хлорид магния 5 мМ, 26 мм бикарбоната натрия, 246mM сахарозы и фенол красный раствор (1:1000) , рН 7,3. Для стерилизации решение, процеживают через 0,22 мкм фильтр и хранят при температуре 4 ° C. Мозжечка ломтиками культивируют в 75% минимально необходимого среднего Eagle (MEM), 25% тепла инактивированной лошадиной сыворотки, 25 мМ HEPES, 1 мМ глутамина, 5 мг / мл, глюкозу, пенициллин (100 ЕД / мл) и стрептомицин (100 ЕД / мл). Фильтры среды, через 0,22 мкм фильтр и хранят при температуре 4 ° С в течение максимум двух недель. Рассеките мозга в ледяной средой ACSF ранее пузырилась с карбогена (95% кислорода и 5% углекислого газа) Отметим, что насыщение карбогена изменится рН раствора таким образом это будет переход от красного до оранжевого. Вскрытие должно проводиться в минимальный промежуток времени возможны будьте осторожны, чтобы не повредить структуру мозга. Нарежьте мозга в сагиттальной разделы 400 мкм использованием vibratome. Сделать сагиттальной вырезать бритвой в одном полушарии, пытается сократить как можно меньше мозжечка; это обеспечит ровную поверхность для резки. Кора используется только для поддержки, чтобы сделать нарезки проще, но поскольку время является важным вопросом удобнее вырезать ростральной половины коры с лезвия бритвы. Используйте цианоакрилат (суперклей), чтобы исправить положение мозга на пластине vibratome металла. Важно, чтобы охладить пластины на льду перед добавлением клея и распространить ее также с помощью иглы трубки для формирования тонкого слоя клея. Если есть превышение суперклей, он будет отключаться от пластины, когда он вступает в контакт с ACSF и образца, будут потеряны. Как только мозг подключен к vibratome плиты, добавить достаточно средств массовой информации ACSF для покрытия мозга и положить лед под пластиной, чтобы держать это холод. Вырезать 400 мкм ломтиками и передача их с пластиковой пипетки Пастера (вырезать наконечник расширить его и избежать повреждения ломтиками) до 6-и клеточных культур пластины, содержащей ACSF на льду. Отдельные мозжечка от остальной части мозга с помощью двух инсулиновые шприцы (шприцы с малым диаметром 28-иглы) при вскрытии микроскопом. Некоторые ломтиками будет суперклей прилагается к краям: это момент, чтобы попытаться удалить его, как это может повлиять на жизнеспособность срез. Важно сделать это аккуратно, не повреждая структуры мозжечка. Передача мозжечка ломтиками до 6-луночных содержащие 30 мм вставки пластины культуры с 0,4 мкм поры. Добавить 1 мл культуральной среды на лунку, которая была заранее обусловлена ​​инкубации в течение не менее 2 часов при 37 ° С и 5% СО 2 (в культуре клеток инкубатор). Место вставки на верхней части средств массовой информации убедившись, что Есть нет воздушных пузырьков под, а затем поместить мозжечка ломтиками (1-3 в вставке) в верхней части вставки убедившись, что они в полной мере расширены и что ни жидкость покрывает их. Аспирируйте избыток средств массовой информации, если это необходимо. Инкубировать при 37 ° С и 5% CO 2 меняется медиакультуры каждые 2 или 3 дня. Лучше всего заменить только часть среды (например, ½ объема) сразу, так как использовались среда содержит часть полученных трофических факторов, которые важны для выживания клеток. 2. Лечение Fas и окрашивание мозжечка фрагменты: Для эксперимента апоптоза задача, мы впервые культуры ломтики в течение 5 дней меняется СМИ в день в пробирке 3 (div3). На DIV5 культур относятся с 0,5 мкг / мл антитела Jo2 агонист Fas, добавив его непосредственно к средствам массовой информации для того, чтобы иметь чистую фоне гибели клеток с изменениями средства массовой информации может вызвать некоторые смертности в культурах. Половина скважин оставлены без рассмотрения в качестве контроля. После 24 часов удалить СМИ под вставки на всасывание. Чтобы исправить ломтиками, добавить 1 мл ледяной 4% PFA ниже и выше 1 мл вставки. Инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре. Через 10 минут удалите PFA и промыть холодной кратко PBS. Следующая удалить PBS и добавьте 1 мл под 1 мл и выше вставка 20% ледяной метанола в PBS и инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре. Вымойте снова PBS и добавьте 1 мл под 1 мл и выше вставить в размере 0,5% Triton-X-100 в PBS для пермеабилизации. Инкубировать минимум 12 часов при температуре 4 ° C. После пермеабилизации, блок с 20% BSA в PBS в течение минимум4 часа при комнатной температуре или на ночь при 4 ° C. На данном этапе ломтиками могут храниться в блокировании решения, по крайней мере 3-х дней при температуре 4 ° C. Для того, чтобы пятно ломтики аккуратно вырезать кусок мембраны вставить прилагаемый к мозжечковой нарезать и перенести его на 24-луночных содержащие PBS. Иммуноокрашивания осуществляется последовательно, сначала с реагентом TUNEL в течение одного часа, а затем с антителами Calbidin ночь. Аспирируйте PBS и добавьте 250 мкл с TUNEL реагента в каждую лунку убедившись, что он покрывает всю поверхность среза. Инкубировать при 37 ° С в течение одного часа в темноте. Через час удалить TUNEL смесь и промыть PBS три раза в течение 10 минут. После последнего вымыть, удалить PBS и добавьте 250 мкл 1 / 1000 разведение антител кальбиндин в ФБР и инкубировать в течение ночи при 4 ° С в темноте. Удалите первичный решение антител и промыть PBS три раза в течение 10 минут. Добавьте 250 мкл вторичными антителами разбавленного 1 / 500 в PBS и выдержать в течение не менее трех часов при комнатной температуре в темноте. Комплект TUNEL мы использовали помечена красным ПМР, поэтому наши вторичные антитела для кальбиндин сопряжена с Alexa-488. Вымойте три раза в течение 10 минут с PBS и смонтировать ломтиками на предметное стекло микроскопа использованием установки средств массовой информации, которая содержит DAPI. Изображение ломтики с использованием конфокальной микроскопии 488 нм и 561 нм длине волны возбуждения для кальбиндин и TUNEL соответственно. 3. Представитель Результаты: Основной задачей этого протокола является возможность генерировать здоровую часть мозжечка культур, тем более что наша конечная считывания будет гибель клеток. Здоровой культуры предстает как тот, где слоем клеток тела полупрозрачным и позволяет вам видеть слоеного структуры мозжечка под микроскопом (рис. 1). Через несколько дней в культуре ломтиками начать редеть и не-нервных клеток можно наблюдать миграцию от краев среза. Темные клетки круглой (скорее всего, макрофаги), которые покрывают ломтиками через несколько дней в культуре, в конечном итоге снижение числа через 10-14 дней в пробирке (рис. 2) 5. Окончательным доказательством жизнеспособности ломтиками является пятном на различных клеточных маркеров, таких как кальбиндин для клеток Пуркинье. На рисунке 3 показана представитель конфокальной микроскопии изображение слоя клеток Пуркинье с несколькими TUNEL положительных ядер. Важно учитывать, что даже если некоторые ломтики получил апоптоза стимул, они только подвергаются в течение 24 часов. Это позволило достаточно времени, чтобы наблюдать фрагментацию ДНК в умирающей клетки с окрашиванием TUNEL, но определенный слой клеток Пуркинье по-прежнему присутствует. Рисунок 1. Здоровый мозжечка срез div2. Это изображение показывает полупрозрачный слой клеток организма и слоеного мозжечка структуры в здоровую часть. Рисунок 2. Здоровый мозжечка срез DIV 7. На этом снимке мы все еще ​​можем наблюдать слоеного структуры мозжечка и появление темных тел клетки. Рисунок 3. Представитель образ Fas обработанных мозжечка срез. Конфокальной Это изображение показывает Пуркинье клеток, окрашенных кальбиндин (зеленый) и апоптоза клеток положительным для окрашивания TUNEL (красный). Клетки Пуркинье, не отображаются в одной строке, но сгруппированы формирования лепестка-подобные структуры.

Discussion

Этот метод описывает один из многих возможных применений нейронных органотипической культур, и это позволило нам изучить влияние апоптоза стимулов в дикого типа и мутантных мозжечка ломтиками.

Наиболее важной частью этого опыта, чтобы иметь возможность последовательно генерировать здоровую мозжечка культур срез. Ключевыми факторами являются рассечение и нарезая технику и способность выполнять протокол хотя бы раз можно, но в то же время будьте осторожны, чтобы не повредить кусочки. Другим важным фактором является подготовка и состав питательной среды, эти культуры очень чувствительны, поэтому нам пришлось испытать несколько рецептов и марки носителей. Даже различных партий сыворотки или любые другие компоненты средств массовой информации могут повлиять на жизнеспособность ломтиками. Мы получили лучшие результаты с лошадиной сыворотки от Invitrogen Лот № 480116.

После мозжечка ломтиками генерируются можно изучать мозжечка развития, электрофизиологии, выживаемость клеток в одиночку или в ответ на раздражители апоптоза, эксайтотоксичность или кислородное голодание. Сравнительные исследования с использованием дикого типа и мутантных мозжечка ломтиками был очень проницательным во многих аспектах функции мозжечка и развития.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
MEM		Invitrogen	11090
Horse Serum		Invitrogen	16050
Hepes		Invitrogen	15630
Glutamine		Invitrogen	25030
Penicillin/ Streptomycin		Invitrogen	15140
Superglue		Krazy Glue
6 well / 24 well cell culture plates		Corning Incorporated	3506/ 3527
30mm culture plate inserts (0.4-μm pore)		Millipore	PICM03050
Purified NA/LE Hamster anti-mouse CD95 (Jo2)		BD Pharmingen	554254
In situ cell death detection kit, TMR red		Roche	12 156 792 910
Rabbit anti-Calbindin D-28k antibody		Swant	CB-38a
Alexa 488-goat anti-rabbit IgG secondary antibody		Invitrogen (Molecular probes)	A-11008
Vectashield Mounting Medium with DAPI		Vector labs	H-1200
Dissecting Microscope		Zeiss Stemi SV 11
Vibratome		Leica
Confocal Microscope		Leica TCS SP2 AOBS