Bu yöntem, Organotipik serebellar kültürlerin üretimi ve farklı serebellar hücre tiplerinin canlılığı belli apoptotik uyaranların etkisi açıklanmıştır.
Nöronal doku Organotipik kültürleri, ilk kez 1947 1,2 Hogue tarafından tanıtıldı ve nörobilim alanında önemli bir atılım teşkil etmiştir . O zamandan beri, bu teknik daha da geliştirilmiş ve henüz Organotipik kültürleri hazırlamak için birçok farklı yolu vardır. Stoppini ve arkadaşları tarafından açıklanan bir uyarlanmış yöntemi burada sundu. Dilimleri hazırlanması ve Gogolla ark. Boyama işlemi 3,4 için.
Bu tekniğin eşsiz bir özelliği, tüm hücresel organizasyonu ve nöron ağları bozulduğu olduğu ayrışmış kültürleri üzerinde büyük bir avantaj sağlayarak, kendi özgün yapısı hipokampus ve serebellum gibi beynin farklı yerlerinde çalışmaya olanak veren. Serebellumun durumda Purkinje hücrelerinin çalışma, ayrışmış temel kültür olarak elde etmek için son derece zor izin verdiğinden bile daha avantajlıdır. Bu yöntem, in vitro olarak serebellum bazı gelişimsel özellikleri yanı sıra çalışmada, yabani tip ve mutant fareler hem de elektrofizyolojik ve farmakolojik deneyler için kullanılabilir .
Apoptotik hücre ölümü ölçmek için TUNEL boyama yöntemi, burada açıklanan, gelişmekte olan beyincik Fas ligand olarak apoptotik uyaranlara etkisini araştırmak için dizayn edilmiştir. TUNEL boyama gibi Calbindin Purkinje hücreleri için hücre tipi özgül belirteçler ile birlikte ise, bir hücre popülasyonu belirli bir şekilde hücre ölümünü değerlendirmek mümkündür. Calbindin boyama da serebellar kültürlerin kalitesini değerlendirmek amacıyla hizmet vermektedir.
Bu yöntem, nöronal Organotipik kültürlerin birçok olası uygulamalar biri açıklar ve yabani tip ve mutant serebellar dilim apoptotik uyaranların etkisini araştırmak için izin verdi.
Bu deneyin en önemli parçası, sürekli olarak sağlıklı serebellar dilim kültürü oluşturmak mümkün olmaktır. Önemli faktörler diseksiyon ve dilimleme tekniği ve mümkün olan en kısa zamanda protokol gerçekleştirme yeteneği, ama aynı zamanda dikkatli dilim zarar görmemesi için. Bir diğer önemli faktör, kültür ortamının hazırlanması ve kompozisyon, bu kültürlerin çok hassastır, bu yüzden biz, medyanın çeşitli yemek tarifleri ve markalar denemek zorunda kaldık. , Serum veya medya herhangi bir diğer bileşenler bile farklı partiler dilim canlılığı etkileyebilir. Biz Invitrogen Lot # 480.116 At Serumu ile en iyi sonuçları var.
Serebellar dilim sonra bir serebellar gelişim, elektrofizyoloji, hücre yaşamını tek başına veya apoptotik uyaranlara eksitotoksisitesi veya oksijensizlik yanıt olarak eğitim görebilirsiniz. Yabani tip ve mutant serebellar dilimleri kullanarak karşılaştırmalı çalışmalar serebellar fonksiyon ve gelişiminin pek çok açıdan çok anlayışlı edilmiştir.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışmada IPSEN Vakfı tarafından finanse edildi. IMV, Moleküler Biyoloji Amerikan Kanser Derneği Profesörü ve Örnek Yaşam Bilimleri Irwin ve Joan Jacobs Başkanı tutar. Bu çalışma NIH, Leducq Vakfı, Meriaux Vakfı, Ellison Tıp Vakfı, Ipsen / Biomeasure, Sanofi Aventis, Prostat Kanseri Vakfı, HN ve Frances C. Berger Vakfı hibe kısmen desteklenmiştir. PAS Nörobilim ve Uyuşturucu (R01 DA019022) Ulusal Enstitüsü McKnight Endowment Fund tarafından finanse edilmektedir. Yazarlar Mark Schmitt teşekkür etmek istiyorum. Grafik sanat, Murat T. Simon tarafından dizayn edilmiştir. Sponsorluk nazik Invitrogen tarafından sağlanmıştır.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
MEM | Invitrogen | 11090 | ||
Horse Serum | Invitrogen | 16050 | ||
Hepes | Invitrogen | 15630 | ||
Glutamine | Invitrogen | 25030 | ||
Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140 | ||
Superglue | Krazy Glue | |||
6 well / 24 well cell culture plates | Corning Incorporated | 3506/ 3527 | ||
30mm culture plate inserts (0.4-μm pore) | Millipore | PICM03050 | ||
Purified NA/LE Hamster anti-mouse CD95 (Jo2) | BD Pharmingen | 554254 | ||
In situ cell death detection kit, TMR red | Roche | 12 156 792 910 | ||
Rabbit anti-Calbindin D-28k antibody | Swant | CB-38a | ||
Alexa 488-goat anti-rabbit IgG secondary antibody | Invitrogen (Molecular probes) | A-11008 | ||
Vectashield Mounting Medium with DAPI | Vector labs | H-1200 | ||
Dissecting Microscope | Zeiss Stemi SV 11 | |||
Vibratome | Leica | |||
Confocal Microscope | Leica TCS SP2 AOBS |