Este método descreve a geração de organotípicas culturas cerebelar eo efeito de determinados estímulos apoptóticos sobre a viabilidade de diferentes tipos de células do cerebelo.
Organotípicas culturas de tecido neuronal foram introduzidas pela primeira vez em 1947 1,2 Hogue, que constituíram um grande avanço no campo da neurociência. Desde então, a técnica foi desenvolvida e, atualmente, existem muitas maneiras diferentes de preparar culturas organotípicas. O método apresentado aqui foi adaptada da descrita por Stoppini et al. Para a preparação das fatias e de Gogolla et al. Para o procedimento de coloração 3,4.
Uma característica exclusiva desta técnica é que ele permite que você estude as diferentes partes do cérebro, como hipocampo ou cerebelo em sua estrutura original, proporcionando uma grande vantagem sobre as culturas dissociadas em que toda a organização celular e redes neuronais são interrompidos. No caso do cerebelo é ainda mais vantajosa, pois permite o estudo das células de Purkinje, extremamente difícil de obter como cultura principal dissociados. Este método pode ser usado para estudar algumas características de desenvolvimento do cerebelo in vitro, bem como para experimentos eletrofisiológicos e farmacológicas, tanto do tipo selvagem e camundongos mutantes.
O método descrito aqui foi projetado para estudar o efeito dos estímulos apoptóticos, tais como ligante Fas no cerebelo em desenvolvimento, usando coloração TUNEL para medir a morte celular por apoptose. Se a coloração TUNEL é combinada com o tipo de marcadores celulares específicos, como calbindina de células de Purkinje, é possível avaliar a morte celular de uma forma população de células específicas. A coloração calbindina também serve o propósito de avaliar a qualidade das culturas de cerebelo.
Este método descreve uma das muitas aplicações possíveis de culturas organotípicas neuronal e nos permitiu estudar o efeito dos estímulos apoptóticos no tipo selvagem e mutante fatias de cerebelo.
A parte mais crítica desta experiência é ser capaz de gerar consistentemente saudável culturas fatia cerebelar. Os factores chave são dissecção e técnica de corte e a capacidade de executar o protocolo no menor tempo possível, mas ao mesmo tempo, tomando cuidado para não danificar as fatias. Outro fator crucial é a preparação ea composição do meio de cultura, essas culturas são muito sensíveis, por isso tivemos de testar várias receitas e marcas de mídia. Mesmo diferentes lotes de soro ou quaisquer outros componentes dos meios de comunicação podem afetar a viabilidade das fatias. Nós temos os melhores resultados com o soro de cavalo de Invitrogen Lot # 480116.
Uma vez que as fatias de cerebelo são gerados pode-se estudar o desenvolvimento do cerebelo, eletrofisiologia, a sobrevivência da célula isolada ou em resposta a estímulos apoptóticos, excitotoxicidade ou privação de oxigênio. Estudos comparativos utilizando tipo selvagem e mutante fatias cerebelar foram muito perspicaz em muitos aspectos da função cerebelar e desenvolvimento.
The authors have nothing to disclose.
Este estudo foi financiado em parte pela Fundação IPSEN. IMV é um Professor Sociedade Americana do Câncer da Biologia Molecular, e detém o Irwin Jacobs e Joan Presidente em Ciências da Vida Exemplar. Este trabalho foi financiado em parte por concessões do NIH, Fundação Leducq, Fundação Meriaux, Medicina Ellison Foundation, Ipsen / Biomeasure, Sanofi Aventis, Câncer de Próstata Foundation, eo HN e Frances C. Berger Foundation. PAS é financiado pelo Fundo de Dotação McKnight de Neurociências e do Instituto Nacional sobre Abuso de Drogas (R01 DA019022). Os autores gostariam de agradecer a Mark Schmitt. Arte gráfica foi desenhada por Jamie T. Simon. Patrocínio foi gentilmente cedido pela Invitrogen.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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MEM | Invitrogen | 11090 | ||
Horse Serum | Invitrogen | 16050 | ||
Hepes | Invitrogen | 15630 | ||
Glutamine | Invitrogen | 25030 | ||
Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140 | ||
Superglue | Krazy Glue | |||
6 well / 24 well cell culture plates | Corning Incorporated | 3506/ 3527 | ||
30mm culture plate inserts (0.4-μm pore) | Millipore | PICM03050 | ||
Purified NA/LE Hamster anti-mouse CD95 (Jo2) | BD Pharmingen | 554254 | ||
In situ cell death detection kit, TMR red | Roche | 12 156 792 910 | ||
Rabbit anti-Calbindin D-28k antibody | Swant | CB-38a | ||
Alexa 488-goat anti-rabbit IgG secondary antibody | Invitrogen (Molecular probes) | A-11008 | ||
Vectashield Mounting Medium with DAPI | Vector labs | H-1200 | ||
Dissecting Microscope | Zeiss Stemi SV 11 | |||
Vibratome | Leica | |||
Confocal Microscope | Leica TCS SP2 AOBS |