Deze methode beschrijft de generatie van organotypische cerebellaire culturen en het effect van bepaalde apoptotische stimuli op de levensvatbaarheid van de verschillende cerebellaire celtypen.
Organotypische culturen van neuronaal weefsel werden voor het eerst geïntroduceerd door Hogue in 1947 1,2 en hebben gevormd een belangrijke doorbraak op het gebied van de neurowetenschappen. Sindsdien werd de techniek verder ontwikkeld en momenteel zijn er veel verschillende manieren om organotypische culturen te bereiden. De hier gepresenteerde methode werd aangepast van de ene beschreven door Stoppini et al.. Voor de voorbereiding van de plakken en van Gogolla et al.. Voor de kleuringsprocedure 3,4.
Een uniek kenmerk van deze techniek is dat het u toestaat om te studeren verschillende delen van de hersenen, zoals hippocampus of cerebellum in hun oorspronkelijke structuur, waardoor een groot voordeel ten opzichte van gedissocieerd culturen waarin alle cellulaire organisatie en neuronale netwerken zijn verstoord. In het geval van het cerebellum is het nog voordeliger omdat het toelaat de studie van de Purkinje cellen, zeer moeilijk te verkrijgen als gedissocieerd primaire cultuur. Deze methode kan worden gebruikt om bepaalde ontwikkelings-functies van het cerebellum in vitro onderzoek, evenals voor elektrofysiologische en farmacologische experimenten in zowel wild type en mutante muizen.
De hier beschreven methode werd ontworpen om het effect van apoptotische stimuli zoals Fas-ligand in de ontwikkelingslanden cerebellum onderzoek, met behulp van TUNEL kleuring tot apoptotische celdood te meten. Als TUNEL kleuring wordt gecombineerd met celtype specifieke markers, zoals de Calbindin voor Purkinje cellen, is het mogelijk om celdood te evalueren in een cel populatie specifieke manier. De Calbindin vlekken dient ook het doel van de evaluatie van de kwaliteit van de cerebellaire culturen.
Deze methode beschrijft een van de vele mogelijke toepassingen van neuronale organotypische culturen en het heeft ons toegestaan om het effect van apoptotische stimuli studie in wild-type en mutant cerebellaire plakjes.
Het meest kritische deel van dit experiment is om te kunnen consequent genereren van gezonde cerebellaire slice culturen. De belangrijkste factoren zijn dissectie en snijden techniek en de mogelijkheid om het protocol uit te voeren in de kortst mogelijke tijd, maar tegelijkertijd zorg dat u de plakjes schade. Een andere cruciale factor is de voorbereiding en samenstelling van de kweekmedia, deze culturen zijn erg gevoelig, dus moesten we een aantal recepten en merken van de media te testen. Zelfs verschillende batches van serum of een andere onderdelen van de media invloed kunnen zijn op de levensvatbaarheid van de schijfjes. We hebben de beste resultaten met het Paard Serum van Invitrogen Lot # 480116.
Zodra de cerebellaire schijfjes worden gegenereerd men kan studeren cerebellaire ontwikkeling, elektrofysiologie, overleving van de cel alleen of in reactie op apoptotische stimuli, excitotoxiciteit of zuurstoftekort. Vergelijkende studies met behulp van wild type en mutante cerebellaire schijfjes zijn zeer verhelderend in vele aspecten van de kleine hersenen en de ontwikkeling.
The authors have nothing to disclose.
Dit onderzoek werd deels gefinancierd door de IPSEN Foundation. IMV is een American Cancer Society hoogleraar Moleculaire biologie, en houdt de Irwin en Joan Jacobs leerstoel Voorbeeldige Life Sciences. Dit werk werd mede ondersteund door subsidies van de NIH, Leducq Foundation, Meriaux Stichting, Ellison Medical Foundation, Ipsen / Biomeasure, Sanofi Aventis, Prostate Cancer Foundation, en de HN-en Frances C. Berger Foundation. PAS wordt gefinancierd door McKnight Endowment Fund voor Neurowetenschappen en het National Institute on Drug Abuse (R01 DA019022). De auteurs willen graag aan Mark Schmitt bedanken. Grafische kunst werd ontworpen door Jamie T. Simon. Sponsoring werd vriendelijk verschaft door Invitrogen.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
MEM | Invitrogen | 11090 | ||
Horse Serum | Invitrogen | 16050 | ||
Hepes | Invitrogen | 15630 | ||
Glutamine | Invitrogen | 25030 | ||
Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140 | ||
Superglue | Krazy Glue | |||
6 well / 24 well cell culture plates | Corning Incorporated | 3506/ 3527 | ||
30mm culture plate inserts (0.4-μm pore) | Millipore | PICM03050 | ||
Purified NA/LE Hamster anti-mouse CD95 (Jo2) | BD Pharmingen | 554254 | ||
In situ cell death detection kit, TMR red | Roche | 12 156 792 910 | ||
Rabbit anti-Calbindin D-28k antibody | Swant | CB-38a | ||
Alexa 488-goat anti-rabbit IgG secondary antibody | Invitrogen (Molecular probes) | A-11008 | ||
Vectashield Mounting Medium with DAPI | Vector labs | H-1200 | ||
Dissecting Microscope | Zeiss Stemi SV 11 | |||
Vibratome | Leica | |||
Confocal Microscope | Leica TCS SP2 AOBS |