このメソッドは、器官小脳文化の世代と異なる小脳の細胞型の生存率に一定のアポトーシス刺激の効果を説明します。
神経組織の器官型培養物は、1947年1,2でホギュが導入され、神経科学の分野で大きなブレークスルーを構成している。それ以来、技術は、器官培養を準備するために多くの異なる方法があるさらに、現在は開発されました。ここで紹介する方法はStoppini らによって記述される1つから翻案されました。スライスの準備のためとGogolla らから。染色手順3,4のために。
このテクニックのユニークな特徴は、すべての細胞組織と神経回路網が中断されているの解離の文化上の大きな利点を提供し、あなたが彼らの元の構造の海馬や小脳などの脳の異なる部分を勉強できることです。それは解離初代培養として取得するにはプルキンエ細胞の研究は、極めて困難なことができるので小脳の場合には、さらに有利である。このメソッドは、in vitroで小脳の特定の発達の特徴を学ぶだけでなく、野生型と変異マウスの両方における電気生理学的および薬理学的実験のために使用することができます。
方法は、アポトーシス細胞死を測定するTUNEL染色を用いて、このような発展途上小脳におけるFasリガンドとしてのアポトーシス刺激の効果を研究するために設計されてここで説明する。 TUNEL染色は、プルキンエ細胞のためのようなカルビンジンような細胞型特異的なマーカーと組み合わせている場合、それは細胞集団特異的に細胞死を評価することが可能である。カルビンジン染色はまた小脳の文化の質を評価の目的を果たします。
このメソッドは、神経器官の文化の多くの可能なアプリケーションの一つを説明し、それは、私たちは野生型と変異型脳切片におけるアポトーシス刺激の効果を検討することができました。
この実験の最も重要な部分は一貫して健康な小脳スライス培養を生成できるようにすることです。主な要因は、解剖やスライシング手法と可能な限り最短時間でプロトコルを実行する機能ですが、同時にスライスを傷つけないように気をつけながら。別の重大な要素は、培地の調製と組成物である、これらの文化は非常に敏感ですので、メディアのいくつかのレシピやブランドをテストしなければならなかった。血清またはメディアの他のコンポーネントのであっても別のバッチは、スライスの生存に影響を与える可能性があります。我々は、Invitrogenのロット#480116からの馬の血清と最良の結果を得た。
小脳スライスが生成されると一小脳開発、電気生理学、単独でまたはアポトーシス刺激、興奮または酸素欠乏に応答して細胞の生存率を検討することができます。野生型と変異型小脳スライスを用いて比較研究は、小脳の機能と開発の多くの面で非常に洞察されている。
The authors have nothing to disclose.
本研究では、イプセン財団によって一部で賄われていた。 IMVは、分子生物学のアメリカの癌協会の教授であり、そして典型的なライフサイエンスのアーウィンとジョーンジェイコブスチェアを保持しています。この作品は、NIH、Leducq財団、Meriaux財団、エリソン医学財団、イプセン/ Biomeasure、サノフィアベンティス、前立腺がん財団、およびHNとフランシスC. Bergerの財団からの補助金によって部分的にサポートされていました。 PASは、神経科学のためのマックナイト基金基金と薬物乱用(R01 DA019022)の国民の協会によって資金を供給される。著者はマークシュミットに感謝します。グラフィックアートはジェイミーT.サイモンによって設計されました。スポンサーが親切にInvitrogen社によって提供された。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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MEM | Invitrogen | 11090 | ||
Horse Serum | Invitrogen | 16050 | ||
Hepes | Invitrogen | 15630 | ||
Glutamine | Invitrogen | 25030 | ||
Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140 | ||
Superglue | Krazy Glue | |||
6 well / 24 well cell culture plates | Corning Incorporated | 3506/ 3527 | ||
30mm culture plate inserts (0.4-μm pore) | Millipore | PICM03050 | ||
Purified NA/LE Hamster anti-mouse CD95 (Jo2) | BD Pharmingen | 554254 | ||
In situ cell death detection kit, TMR red | Roche | 12 156 792 910 | ||
Rabbit anti-Calbindin D-28k antibody | Swant | CB-38a | ||
Alexa 488-goat anti-rabbit IgG secondary antibody | Invitrogen (Molecular probes) | A-11008 | ||
Vectashield Mounting Medium with DAPI | Vector labs | H-1200 | ||
Dissecting Microscope | Zeiss Stemi SV 11 | |||
Vibratome | Leica | |||
Confocal Microscope | Leica TCS SP2 AOBS |