Questo metodo descrive la generazione di organotipica culture cerebellare e l'effetto di alcuni stimoli apoptotici sulla vitalità dei diversi tipi di cellule del cervelletto.
Culture organotipica del tessuto neuronale sono stati introdotti da Hogue nel 1947 1,2 e hanno costituito un importante passo avanti nel campo delle neuroscienze. Da allora, la tecnica è stata sviluppata ulteriormente e attualmente ci sono molti modi diversi per preparare culture organotipica. Il metodo presentato qui è stato adattato da quello descritto da Stoppini et al. Per la preparazione delle fette e da Gogolla et al. Per la procedura di colorazione 3,4.
Una caratteristica unica di questa tecnica è che permette di studiare diverse parti del cervello come l'ippocampo e cervelletto nella loro struttura originale, garantendo un grande vantaggio rispetto culture dissociato in cui sono sconvolto tutta l'organizzazione cellulare e reti neuronali. Nel caso del cervelletto è ancora più vantaggiosa perché consente lo studio delle cellule di Purkinje, estremamente difficili da ottenere come dissociata coltura principale. Questo metodo può essere utilizzato per studiare alcune caratteristiche dello sviluppo del cervelletto in vitro, come pure per studi elettrofisiologici e farmacologici, sia wild-type e topi mutanti.
Il metodo qui descritto è stato progettato per studiare l'effetto degli stimoli apoptotici, come ligando Fas nel cervelletto di sviluppo, utilizzando colorazione TUNEL per misurare la morte cellulare. Se la colorazione TUNEL è combinato con marcatori tipo di cellule specifiche, come calbindin per le cellule di Purkinje, è possibile valutare la morte cellulare in maniera specifica popolazione di cellule. La colorazione calbindin ha inoltre lo scopo di valutare la qualità delle culture del cervelletto.
Questo metodo descrive una delle molte applicazioni possibili di culture neuronali organotipica e ci ha permesso di studiare l'effetto degli stimoli apoptotici nel wild-type e mutanti fette cerebellare.
La parte più critica di questo esperimento è quello di essere in grado di generare costantemente sano culture fetta cerebellare. I fattori chiave sono la dissezione e la tecnica di taglio e la capacità di eseguire il protocollo nel minor tempo possibile, ma allo stesso tempo facendo attenzione a non danneggiare le fette. Un altro fattore cruciale è la preparazione e la composizione dei terreni di coltura, queste culture sono molto sensibili, quindi abbiamo dovuto provare diverse ricette e marche di supporti. Anche diversi lotti di siero o di altri componenti dei mass media possono influenzare la vitalità delle fette. Abbiamo ottenuto i migliori risultati con il siero di cavallo da Lot Invitrogen # 480116.
Una volta che le fette cerebellare si generano si può studiare lo sviluppo del cervelletto, elettrofisiologia, la sopravvivenza delle cellule da soli o in risposta a stimoli apoptotici, eccitotossicità o mancanza di ossigeno. Studi comparativi con wild-type e mutanti fette cerebellare sono stati molto perspicace in molti aspetti della funzione cerebellare e sviluppo.
The authors have nothing to disclose.
Questo studio è stato finanziato in parte dalla Fondazione Ipsen. IMV è un americano Cancer Society Professore di Biologia Molecolare, ed è titolare della cattedra e Joan Irwin Jacobs in Scienze della vita esemplare. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da finanziamenti del NIH, Fondazione Leducq, Meriaux Fondazione, Ellison Medical Foundation, Ipsen / Biomeasure, Sanofi Aventis, Prostate Cancer Foundation, e la HN e Frances C. Berger Foundation. PAS è finanziato dal Fondo per McKnight Endowment Neuroscienze e il National Institute on Drug Abuse (R01 DA019022). Gli autori desiderano ringraziare Mark Schmitt. Grafica è stato progettato da Jamie T. Simon. Sponsorizzazione è stato gentilmente fornito da Invitrogen.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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MEM | Invitrogen | 11090 | ||
Horse Serum | Invitrogen | 16050 | ||
Hepes | Invitrogen | 15630 | ||
Glutamine | Invitrogen | 25030 | ||
Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140 | ||
Superglue | Krazy Glue | |||
6 well / 24 well cell culture plates | Corning Incorporated | 3506/ 3527 | ||
30mm culture plate inserts (0.4-μm pore) | Millipore | PICM03050 | ||
Purified NA/LE Hamster anti-mouse CD95 (Jo2) | BD Pharmingen | 554254 | ||
In situ cell death detection kit, TMR red | Roche | 12 156 792 910 | ||
Rabbit anti-Calbindin D-28k antibody | Swant | CB-38a | ||
Alexa 488-goat anti-rabbit IgG secondary antibody | Invitrogen (Molecular probes) | A-11008 | ||
Vectashield Mounting Medium with DAPI | Vector labs | H-1200 | ||
Dissecting Microscope | Zeiss Stemi SV 11 | |||
Vibratome | Leica | |||
Confocal Microscope | Leica TCS SP2 AOBS |