Cette méthode décrit la génération de cultures organotypiques cérébelleux et l'effet de certains stimuli apoptotiques sur la viabilité des différents types de cellules du cervelet.
Cultures organotypiques de tissu neuronal ont d'abord été introduite par Hogue en 1947 1,2 et ont constitué une percée majeure dans le domaine des neurosciences. Depuis lors, la technique a été développée et actuellement il ya de nombreuses façons de préparer des cultures organotypiques. La méthode présentée ici a été adaptée de celle décrite par Stoppini et al. Pour la préparation des tranches et de Gogolla et al. Pour la procédure de 3,4 coloration.
Une caractéristique unique de cette technique est qu'elle vous permet d'étudier les différentes parties du cerveau comme l'hippocampe ou du cervelet dans leur structure d'origine, offrant un gros avantage sur les cultures dissociées dans laquelle toute l'organisation cellulaire et les réseaux neuronaux sont perturbés. Dans le cas du cervelet, il est encore plus avantageuse car elle permet l'étude des cellules de Purkinje, extrêmement difficile d'obtenir que la culture principale dissociées. Cette méthode peut être utilisée pour étudier certaines caractéristiques développementales du cervelet in vitro, ainsi que pour des expériences électrophysiologiques et pharmacologiques dans les deux de type sauvage et des souris mutantes.
La méthode décrite ici a été conçu pour étudier l'effet de stimuli apoptotiques tels que Fas ligand dans le cervelet en développement, utilisant une coloration TUNEL pour mesurer la mort cellulaire par apoptose. Si coloration TUNEL est combiné avec des marqueurs type de cellule spécifique, comme pour les cellules de Purkinje calbindine, il est possible d'évaluer la mort cellulaire d'une manière population cellulaire spécifique. La coloration calbindine sert aussi le but d'évaluer la qualité des cultures du cervelet.
Cette méthode décrit l'une des nombreuses applications possibles des cultures organotypiques neuronale et il nous a permis d'étudier l'effet de stimuli apoptotiques de type sauvage et mutant tranches cérébelleux.
La partie la plus critique de cette expérience est d'être capable de générer constamment de saines cultures tranche de cervelet. Les facteurs clés sont la dissection et la technique de tranchage et la capacité d'exécuter le protocole dans le moins de temps possible, mais en même temps, en faisant attention à ne pas endommager les tranches. Un autre facteur crucial est la préparation et la composition des milieux de culture, ces cultures sont très sensibles, alors nous avons dû tester plusieurs recettes et les marques de médias. Même les différents lots de sérum ou de tout autre composant du média pourrait affecter la viabilité des tranches. Nous avons obtenu les meilleurs résultats avec le sérum de cheval à partir du lot # 480116 Invitrogen.
Une fois les tranches de cervelet sont générés, on peut étudier le développement du cervelet, de l'électrophysiologie, la survie cellulaire, seul ou en réponse à des stimuli apoptotiques, excitotoxicité ou la privation d'oxygène. Des études comparatives à l'aide de type sauvage et mutant tranches cérébelleuses ont été très perspicaces dans de nombreux aspects de la fonction cérébelleuse et le développement.
The authors have nothing to disclose.
Cette étude a été financée en partie par la Fondation IPSEN. IMV est professeur American Cancer Society of Molecular Biology, et titulaire de la Chaire Irwin et Joan Jacobs en sciences de vie exemplaire. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions du NIH, Leducq Foundation, Fondation Mériaux, Ellison Medical Foundation, Ipsen / Biomeasure, Sanofi Aventis, Prostate Cancer Foundation, et le HN et Frances C. Berger Foundation. Le PAS est financé par McKnight Fonds de dotation pour les neurosciences et le National Institute on Drug Abuse (R01 DA019022). Les auteurs tiennent à remercier Mark Schmitt. Art graphique a été conçue par Jamie T. Simon. Parrainage a été aimablement fourni par Invitrogen.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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MEM | Invitrogen | 11090 | ||
Horse Serum | Invitrogen | 16050 | ||
Hepes | Invitrogen | 15630 | ||
Glutamine | Invitrogen | 25030 | ||
Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140 | ||
Superglue | Krazy Glue | |||
6 well / 24 well cell culture plates | Corning Incorporated | 3506/ 3527 | ||
30mm culture plate inserts (0.4-μm pore) | Millipore | PICM03050 | ||
Purified NA/LE Hamster anti-mouse CD95 (Jo2) | BD Pharmingen | 554254 | ||
In situ cell death detection kit, TMR red | Roche | 12 156 792 910 | ||
Rabbit anti-Calbindin D-28k antibody | Swant | CB-38a | ||
Alexa 488-goat anti-rabbit IgG secondary antibody | Invitrogen (Molecular probes) | A-11008 | ||
Vectashield Mounting Medium with DAPI | Vector labs | H-1200 | ||
Dissecting Microscope | Zeiss Stemi SV 11 | |||
Vibratome | Leica | |||
Confocal Microscope | Leica TCS SP2 AOBS |