שיטה זו מתארת את הדור של תרבויות cerebellar organotypic ואת ההשפעה של גירויים מסוימים אפופטוטיים על הכדאיות של סוגי תאים שונים cerebellar.
תרבויות Organotypic של רקמה עצבית הוצגו לראשונה בשנת 1947 על ידי הוג 1,2 ו היוו פריצת דרך בתחום מדעי המוח. מאז, הטכניקה פותחה עוד יותר, וכיום ישנם דרכים רבות להכין תרבויות organotypic. השיטה המוצגת כאן הותאמה מזו המתוארת על ידי Stoppini et al. להכנת פרוסות ומן Gogolla et al. עבור ההליך מכתים 3,4.
תכונה ייחודית של הטכניקה הזו הוא שהיא מאפשרת לך ללמוד בחלקים שונים של המוח כגון ההיפוקמפוס במוח הקטן או במבנה המקורי שלהם, מתן יתרון גדול על פני תרבויות ניתק שבו כל ארגון הסלולר רשתות נוירונים הם שיבשו. במקרה של המוח הקטן זה עוד יותר יתרון משום שהוא מאפשר את המחקר בתאי פורקינג', קשה מאוד להשיג כתרבות העיקרית ניתק. שיטה זו יכולה לשמש כדי לחקור תכונות התפתחותי מסוים של המוח הקטן במבחנה, כמו גם עבור ניסויים אלקטרו תרופתי מסוג שני בר עכברים שעברו מוטציה.
השיטה המתוארת כאן נועד לחקור את ההשפעה של גירויים אפופטוטיים כגון ליגנד פאס במוח הקטן המתפתח, באמצעות מכתים TUNEL למדוד מוות של תאים אפופטוטיים. אם מכתים TUNEL משולב עם סמנים סוג תא מסוים, כגון Calbindin עבור תאים פורקינג', אפשר להעריך מוות של תאים באופן תא אוכלוסייה ספציפיים. מכתים Calbindin גם משרתת את המטרה של הערכת האיכות של תרבויות cerebellar.
שיטה זו מתארת את אחד יישומים אפשריים רבים של תרבויות organotypic עצבי והיא אפשרה לנו ללמוד את ההשפעה של גירויים אפופטוטיים בסוג בר פרוסות cerebellar מוטציה.
החלק הקריטי ביותר של ניסוי זה הוא להיות מסוגל לייצר בעקביות בריא תרבויות פרוסה cerebellar. הגורמים העיקריים הם לנתיחה וטכניקה לחתוך את היכולת לבצע את הפרוטוקול בזמן שפחות, אבל באותו הזמן נזהר לא לפגוע פרוסות. גורם נוסף חשוב הוא הכנה הרכב של התקשורת תרבות, תרבויות אלה רגישים מאוד, ולכן היינו צריכים לבדוק כמה מתכונים המותגים ואת התקשורת. גם קבוצות שונות של סרום או כל רכיב אחר של התקשורת להשפיע על הכדאיות של הפרוסות. קיבלנו את התוצאות הטובות ביותר עם סרום הסוס ממגרש Invitrogen # 480116.
לאחר פרוסות cerebellar נוצרות אחד יכול ללמוד פיתוח cerebellar, electrophysiology, הישרדות התא לבד או בתגובה לגירויים אפופטוטיים, excitotoxicity או מחסור בחמצן. מחקרים השוואתיים באמצעות סוג בר פרוסות cerebellar מוטציה כבר תובנה מאוד בהיבטים רבים של פיתוח פונקציה cerebellar ו.
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה מומן בחלקו על ידי קרן IPSEN. IMV היא האגודה האמריקנית למלחמה בסרטן פרופ 'לביולוגיה מולקולרית, ואת הקתדרה ארווין וג'ואן ג'ייקובס במדעי החיים למופת. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי תרומות של NIH, Leducq Foundation, קרן Meriaux, אליסון רפואי הקרן, Ipsen / Biomeasure, סאנופי אוונטיס, סרטן הערמונית קרן, ואת ח"נ ופרנסס ג קרן ברגר. PAS ממומנת על ידי הקרן קרן מק 'נייט למדעי המוח לבין המכון הלאומי לשימוש בסמים (R01 DA019022). המחברים מבקשים להודות מרק שמיט. אמנות גרפי תוכנן על ידי ג'יימי טי סיימון. חסות סופק על ידי חביב Invitrogen.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
MEM | Invitrogen | 11090 | ||
Horse Serum | Invitrogen | 16050 | ||
Hepes | Invitrogen | 15630 | ||
Glutamine | Invitrogen | 25030 | ||
Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140 | ||
Superglue | Krazy Glue | |||
6 well / 24 well cell culture plates | Corning Incorporated | 3506/ 3527 | ||
30mm culture plate inserts (0.4-μm pore) | Millipore | PICM03050 | ||
Purified NA/LE Hamster anti-mouse CD95 (Jo2) | BD Pharmingen | 554254 | ||
In situ cell death detection kit, TMR red | Roche | 12 156 792 910 | ||
Rabbit anti-Calbindin D-28k antibody | Swant | CB-38a | ||
Alexa 488-goat anti-rabbit IgG secondary antibody | Invitrogen (Molecular probes) | A-11008 | ||
Vectashield Mounting Medium with DAPI | Vector labs | H-1200 | ||
Dissecting Microscope | Zeiss Stemi SV 11 | |||
Vibratome | Leica | |||
Confocal Microscope | Leica TCS SP2 AOBS |