이 방법은 organotypic 소뇌 문화의 생성 및 다른 소뇌 세포 유형의 생존 능력에 특정 apoptotic 자극의 효과를 설명합니다.
의 연결 조직 Organotypic 문화가 처음 1947 년 1,2 호그에 의해 소개되었으며 신경 과학 분야의 주요 돌파구를 형성했습니다. 그 이후,이 기술은 더욱 발전하여 현재 organotypic 문화를 준비하는 방법에는 여러 가지가 있습니다했습니다. 방법은 Stoppini 외에 기술된 하나에서 적응되었다 여기에 제시했습니다. 슬라이스의 준비 및 Gogolla 외에서. 얼룩 절차 3,4하십시오.
이 기법의 독특한 기능은 모든 세포 조직과의 연결 네트워크가 중단되는 dissociated 문화 비해 큰 장점을 제공합니다, 당신이 원래 구조로 해마 또는 소뇌 등 뇌의 다른 부분을 공부 수 있도록하는 것입니다. 그것이 dissociated 기본 문화로 얻을 수 Purkinje 세포의 연구가 매우 어렵습 수 있기 때문에 소뇌의 경우는 훨씬 더 유리한 것입니다. 이 방법은 체외에서 소뇌의 특정 발달 기능을 연구뿐만 아니라, 야생의 종류와 돌연변이 생쥐 모두에서 electrophysiological 및 약리 실험하는 데 사용할 수 있습니다.
방법은 apoptotic 세포 죽음을 측정하는 TUNEL 염색법을 사용하여 이러한 개발 소뇌의 파의 리간드로 apoptotic 자극의 효과를 연구하기 위해 설계되었습니다 여기에 설명되어 있습니다. TUNEL의 얼룩이 Purkinje 세포에 대한 이러한 Calbindin 같은 세포 유형 특정 마커와 결합하는 경우, 그것은 세포 인구 구체적인 방식으로 세포 죽음을 평가하는 것이 가능합니다. Calbindin의 얼룩은 또한 소뇌 문화의 품질을 평가의 목적을 제공합니다.
이 방법의 연결 organotypic 문화의 여러 가지 응용 프로그램 중 하나를 설명하고 그것은 우리가 야생 유형 및 돌연변이 소뇌 조각에서 apoptotic 자극의 효과를 연구하기 위해 수 있습니다.
본 실험의 가장 중요한 부분은 지속적으로 건강 소뇌 슬라이스 문화를 생성할 수 있도록합니다. 핵심 요소는 해부하고 깔끔히 기술과 가능한 최소 시간에 프로토콜을 수행할 수있는 능력이 있지만, 동시에 신중하면 조각을 손상하지 않습니다. 또 다른 중요한 요인은 문화 미디어의 준비 및 구성이며, 이러한 문화는 매우 민감합니다, 그래서 우리는 미디어의 여러 조리법과 브랜드를 테스트했습니다. 혈청 또는 미디어의 다른 구성 요소도 다른 배치는 조각의 생존에 영향을 미칠 수 있습니다. 우리는 Invitrogen 롯 # 480116에서 호스의 세럼과 함께 최상의 결과가 나왔어요.
소뇌 슬라이스가 생성되면 하나는 소뇌 개발, 전기 생리학, 세포 생존 혼자 또는 apoptotic 자극, excitotoxicity 또는 산소가 결핍되어서에 대한 응답으로 공부를하실 수 있습니다. 야생 타입과 돌연변이 소뇌 조각을 사용하여 비교 연구는 소뇌 기능과 개발의 여러 측면에서 매우 통찰력이있다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 입슨 재단에 의해 일부 자금했다. IMV는 분자 생물학의 미국 암 협회 교수이며, 모범적인 생명 과학의 어윈 제이콥스와 조안의 의자를 보유하고 있습니다. 이 작품은 NIH, Leducq 재단 Meriaux 재단 엘리슨 의료 재단 입슨 / Biomeasure, Sanofi Aventis, 전립선 암 재단과 HN과 프랜시스 C. 버거 재단의 보조금에 의해 일부 지원되었다. PAS은 신경 과학 및 약물 남용 (R01 DA019022)에있는 국립 연구소에 대한 맥나이트 엔다우먼트 기금 후원됩니다. 저자 마크 슈미트 감사하고 싶습니다. 그래픽 아트는 제이미 T. 사이먼에 의해 디자인되었다. 스폰서가 친절하게 Invitrogen에 의해 제공되었다.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
MEM | Invitrogen | 11090 | ||
Horse Serum | Invitrogen | 16050 | ||
Hepes | Invitrogen | 15630 | ||
Glutamine | Invitrogen | 25030 | ||
Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140 | ||
Superglue | Krazy Glue | |||
6 well / 24 well cell culture plates | Corning Incorporated | 3506/ 3527 | ||
30mm culture plate inserts (0.4-μm pore) | Millipore | PICM03050 | ||
Purified NA/LE Hamster anti-mouse CD95 (Jo2) | BD Pharmingen | 554254 | ||
In situ cell death detection kit, TMR red | Roche | 12 156 792 910 | ||
Rabbit anti-Calbindin D-28k antibody | Swant | CB-38a | ||
Alexa 488-goat anti-rabbit IgG secondary antibody | Invitrogen (Molecular probes) | A-11008 | ||
Vectashield Mounting Medium with DAPI | Vector labs | H-1200 | ||
Dissecting Microscope | Zeiss Stemi SV 11 | |||
Vibratome | Leica | |||
Confocal Microscope | Leica TCS SP2 AOBS |