Este método describe la generación de organotípicos culturas del cerebelo y el efecto de ciertos estímulos apoptóticos sobre la viabilidad de los diferentes tipos de células del cerebelo.
Cultivos organotípicos de tejido neuronal se introdujeron por primera vez por Hogue en 1947 de 1,2 y han constituido un gran avance en el campo de la neurociencia. Desde entonces, la técnica se desarrolló aún más y actualmente hay muchas formas diferentes de preparar cultivos organotípicos. El método presentado aquí es una adaptación de la descrita por Stoppini et al. Para la preparación de los cortes y de Gogolla et al. Por el procedimiento de tinción 3,4.
Una característica única de esta técnica es que permite estudiar las diferentes partes del cerebro como el hipocampo y cerebelo en su estructura original, proporcionando una gran ventaja sobre los cultivos disociados en el que se interrumpen todas las de la organización celular y las redes neuronales. En el caso de que el cerebelo es aún más favorable, ya que permite el estudio de las células de Purkinje, muy difícil de obtener como cultivo primario disociados. Este método puede ser usado para estudiar algunas características del desarrollo del cerebelo in vitro, así como para los experimentos electrofisiológicos y farmacológicos, tanto de tipo salvaje y ratones mutantes.
El método descrito aquí fue diseñado para estudiar el efecto de los estímulos apoptóticos como ligando de Fas en el cerebelo en desarrollo, mediante la tinción de TUNEL para medir la muerte celular por apoptosis. Si la tinción de TUNEL se combina con marcadores tipo específico de célula, como calbindina de las células de Purkinje, es posible evaluar la muerte celular de una manera la población de células específicas. La tinción calbindina también sirve el propósito de evaluar la calidad de las culturas del cerebelo.
Este método describe una de las muchas aplicaciones posibles de cultivos organotípicos neuronal y que nos ha permitido estudiar el efecto de los estímulos de apoptosis de tipo salvaje y mutante rodajas de cerebelo.
La parte más crítica de este experimento es ser capaz de generar consistentemente saludable culturas trozo del cerebelo. Los factores clave son la disección y el método de los cortes y la capacidad para llevar a cabo el protocolo en el menor tiempo posible, pero al mismo tiempo teniendo cuidado de no dañar los trozos. Otro factor crucial es la preparación y la composición de los medios de cultivo, estos cultivos son muy sensibles, así que tuvimos que probar varias recetas y las marcas de los medios de comunicación. Incluso los diferentes lotes de suero o cualquier otro componente de los medios de comunicación podría afectar la viabilidad de los sectores. Tenemos los mejores resultados con el suero de caballo de Lot # 480116 Invitrogen.
Una vez que los cortes del cerebelo se generan se puede estudiar el desarrollo del cerebelo, la electrofisiología, la supervivencia de las células solas o en respuesta a estímulos apoptóticos, excitotoxicidad, o la falta de oxígeno. Los estudios comparativos con el tipo salvaje y mutante rebanadas del cerebelo han sido muy profundas en muchos aspectos de la función del cerebelo y el desarrollo.
The authors have nothing to disclose.
Este estudio fue financiado en parte por la Fundación Ipsen. IMV es un profesor Sociedad Americana del Cáncer de Biología Molecular, y el titular de la Cátedra Irwin y Joan Jacobs en Ciencias de la vida ejemplar. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del NIH, Fundación Leducq, Fundación Meriaux, Ellison Medical Foundation, Ipsen / Biomeasure, Sanofi Aventis, Prostate Cancer Foundation, y HN y Frances C. Berger Fundación. PAS es financiado por McKnight Fondo de Dotación para la Neurociencia y el Instituto Nacional sobre Abuso de Drogas (R01 DA019022). Los autores desean agradecer a Mark Schmitt. Arte gráfico fue diseñado por Jamie T. Simon. Patrocinio fue proporcionado amablemente por Invitrogen.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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MEM | Invitrogen | 11090 | ||
Horse Serum | Invitrogen | 16050 | ||
Hepes | Invitrogen | 15630 | ||
Glutamine | Invitrogen | 25030 | ||
Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140 | ||
Superglue | Krazy Glue | |||
6 well / 24 well cell culture plates | Corning Incorporated | 3506/ 3527 | ||
30mm culture plate inserts (0.4-μm pore) | Millipore | PICM03050 | ||
Purified NA/LE Hamster anti-mouse CD95 (Jo2) | BD Pharmingen | 554254 | ||
In situ cell death detection kit, TMR red | Roche | 12 156 792 910 | ||
Rabbit anti-Calbindin D-28k antibody | Swant | CB-38a | ||
Alexa 488-goat anti-rabbit IgG secondary antibody | Invitrogen (Molecular probes) | A-11008 | ||
Vectashield Mounting Medium with DAPI | Vector labs | H-1200 | ||
Dissecting Microscope | Zeiss Stemi SV 11 | |||
Vibratome | Leica | |||
Confocal Microscope | Leica TCS SP2 AOBS |