Denna metod beskriver generationen organotypic cerebellar kulturer och effekten av vissa apoptotiska stimuli på lönsamheten på olika lillhjärnan celltyper.
Organotypic kulturer av neuronala vävnader infördes först genom Hogue 1947 1,2 och har utgjort ett stort genombrott inom området neurovetenskap. Sedan dess har tekniken utvecklats ytterligare och för närvarande finns många olika sätt att förbereda organotypic kulturer. Den metod som presenteras här har anpassats jämfört med beskrivningen av Stoppini et al. För beredning av skivor och från Gogolla et al. För färgningsproceduren 3,4.
Unikt för denna teknik är att det tillåter dig att studera olika delar av hjärnan såsom hippocampus och cerebellum i sin ursprungliga struktur, vilket ger en stor fördel över dissocierade kulturer där alla cellulära organisation och neurala nätverk störs. I fallet av lillhjärnan det är ännu mer fördelaktigt, eftersom den tillåter att studera Purkinje celler, mycket svårt att få så dissocierade primära kultur. Denna metod kan användas för att studera vissa utvecklings-funktioner i lillhjärnan in vitro, samt för elektrofysiologiska och farmakologiska experiment i både vildtyp och muterade möss.
Metoden som beskrivs här var utformad för att studera effekten av apoptotiska stimuli som Fas ligand i utvecklingsländerna lillhjärnan, med hjälp av Tunel färgning för att mäta apoptotisk celldöd. Om Tunel färgning kombineras med celltyp specifika markörer, såsom Calbindin för Purkinje celler är det möjligt att utvärdera celldöd i en cell population visst sätt. Den Calbindin färgning tjänar också syftet att utvärdera kvaliteten på lillhjärnan kulturer.
Denna metod beskriver en av många möjliga tillämpningar av neuronala organotypic kulturer och det har vi kunnat studera effekten av apoptotiska stimuli i vildtyp och mutant cerebellär skivor.
Den mest kritiska delen av detta experiment är att kunna att konsekvent generera friska cerebellär slice kulturer. De viktigaste faktorerna är dissekering och skivning teknik och förmågan att utföra protokollet på minsta möjliga tid, men samtidigt var försiktig så du inte skadar skivorna. En annan avgörande faktor är att förbereda och sammansättning kulturmedia dessa kulturer är mycket känsliga, så vi fick testa flera recept och märken av media. Även olika partier av serum eller alla andra komponenter i media kan påverka lönsamheten i skivor. Vi fick det bästa resultatet med hästen Serum från Invitrogen Lot # 480.116.
När cerebellär skivor genereras man kan studera lillhjärnan utveckling, elektrofysiologi, cellöverlevnad ensam eller som svar på apoptotiska stimuli, excitotoxicity eller syrebrist. Jämförande studier med vildtyp och mutant cerebellär skivor har varit mycket insiktsfulla i många aspekter av lillhjärnans funktion och utveckling.
The authors have nothing to disclose.
Denna studie har finansierats delvis av Ipsen stiftelsen. IMV är en American Cancer Society professor i molekylärbiologi, och innehar Irwin och Joan Jacobs ordförande på ett föredömligt Life Sciences. Detta arbete stöddes delvis av anslag från NIH, Leducq Foundation, Meriaux stiftelsen, Ellison Medical Foundation, Ipsen / Biomeasure, Sanofi Aventis, prostatacancer Foundation och HN och Frances C. Berger Stiftelsen. PAS är finansierat av McKnight Endowment fonden för neurovetenskap och National Institute on Drug Abuse (R01 DA019022). Författarna vill tacka Mark Schmitt. Grafik ritades av Jamie T. Simon. Sponsring vänligt lämnades av Invitrogen.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
MEM | Invitrogen | 11090 | ||
Horse Serum | Invitrogen | 16050 | ||
Hepes | Invitrogen | 15630 | ||
Glutamine | Invitrogen | 25030 | ||
Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140 | ||
Superglue | Krazy Glue | |||
6 well / 24 well cell culture plates | Corning Incorporated | 3506/ 3527 | ||
30mm culture plate inserts (0.4-μm pore) | Millipore | PICM03050 | ||
Purified NA/LE Hamster anti-mouse CD95 (Jo2) | BD Pharmingen | 554254 | ||
In situ cell death detection kit, TMR red | Roche | 12 156 792 910 | ||
Rabbit anti-Calbindin D-28k antibody | Swant | CB-38a | ||
Alexa 488-goat anti-rabbit IgG secondary antibody | Invitrogen (Molecular probes) | A-11008 | ||
Vectashield Mounting Medium with DAPI | Vector labs | H-1200 | ||
Dissecting Microscope | Zeiss Stemi SV 11 | |||
Vibratome | Leica | |||
Confocal Microscope | Leica TCS SP2 AOBS |