Summary
このプロトコルは、蛍光イメージングによるミトコンドリアのカルシウムフラックスのリアルタイム測定のための方法を説明します。方法は、選択的にミトコンドリアで発現する循環permutated YFPベースのデュアル励起レシオメトリックカルシウムセンサー（レシオメトリックpericam - MT）を利用しています。
Abstract
様々な刺激に応答して細胞内カルシウム濃度のダイナミックな変化は、増殖、分化、およびアポトーシス1など多くの細胞プロセスを調節する。アポトーシス時には、ミトコンドリアのカルシウムの蓄積は、細胞質ゾル2にミトコンドリアからアポトーシス因子の放出を促進する。それは、直接アポトーシス間にその場で生きている細胞でミトコンドリアのカルシウムを測定するために興味深い。デュアル励起レシオメトリックおよび非レシオメトリック合成カルシウム指示薬染料でロードされた細胞の高分解能蛍光イメージングは、細胞内カルシウムシグナル伝達のさまざまな側面を研究するために信頼性の高い多目的なツールであることが証明されています。これらの手法を用いて細胞内カルシウムフラックスを測定することは比較的簡単です。しかし、このようなrhodo -の異形2とrhodo -の異形FFなどの合成カルシウムインジケータを使用して無傷の細胞のミトコンドリア内のカルシウム濃度を測定することはより困難です。ミトコンドリアをターゲットとする合成指標は、ミトコンドリアのカルシウムの反復的な増加への対応を平滑化し、ミトコンドリアの形態3を中断している。さらに、合成指標は、長期的な実験には適していません数時間にわたってミトコンドリアから漏れする傾向がある。このように、ミトコンドリアを標的と緑色蛍光タンパク質（GFP）4またはエクオリン5に基づいて遺伝的に符号化されたカルシウムの指標は大幅にミトコンドリアのカルシウム動態の測定を容易にしている。ここでは、さまざまな刺激に応答してミトコンドリア内カルシウムフラックスのリアルタイム計測のためのシンプルな方法を説明します。メソッドは、選択的にミトコンドリアをターゲットとする"レシオメトリック- pericam"の蛍光顕微鏡法に基づいています。レシオメトリックpericamは、循環順序を変える黄色蛍光タンパク質とカルモジュリン4の融合に基づいて、カルシウム指示薬です。 515 nm付近のピーク発光スペクトルは、、変わらないまま。レシオメトリックpericamへのカルシウムの結合は、415 nmから494 nmまでの励起ピークのシフトを引き起こすレシオメトリックpericamは約1.7μM4のin vitroでの解離定数を持つ単一のカルシウムイオンを結合する。レシオメトリックpericamのこれらのプロパティは、ミトコンドリアのカルシウム濃度の急激かつ長期的な変化の定量化を可能にする。さらに、我々は一般に入手可能なフィルターセットを持つ標準ワイドフィールドカルシウムイメージング顕微鏡にこの方法論の適応を説明します。二つの異なるアゴニスト、プリン作動性アゴニストATPとアポトーシス誘導剤のスタウロスポリンを使用して、我々は、この方法は時間の秒の時間分解能でミトコンドリアのカルシウム濃度の変化を監視するための適切であることを示している。さらに、我々はまた、レシオメトリックpericamはまた、アポトーシス中にミトコンドリアの分裂/断片化を測定するための有用であることを示している。このように、レシオメトリックpericam、特によくアポトーシス時のミトコンドリアのカルシウム動態の連続的な長期的な測定に適しています。
Protocol
1。 Pericam - MTのトランスフェクションと細胞調製。
- 標準の6ウェル培養プレートに入れ、滅菌ガラス製カバースリップ上にプレートのHeLa細胞トランスフェクションの前に夜。
- メーカー（Invitrogen社）によって提案されたDNA /リポフェクトアミン2000複合体を準備します。我々は、レシオメトリック- pericam - MT発現ベクター4μgのと各ウェルのためのOpti - MEM 0.5mlに希釈したリポフェクタミン2000の10μLを使用してください。細胞はトランスフェクションの前に〜70％コンフルエントにする必要があります。
- 抗生物質なしで同じメディアを1.5 mLで各ウェルのHeLa細胞培養培地（ダルベッコ改変イーグル培地、10％FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン）を交換してください。
- DNA /トランスフェクトされる各ウェルにリポフェクタミン複合体を追加。 37℃、5％CO 2でインキュベーター内で4時間振盪インキュベートで軽く混ぜる。
- 抗生物質を培地に抗生物質を含まない培地を交換してください。細胞は、イメージングの前に1-2日間レシオメトリックpericamを表現することができます。
2。顕微鏡のセットアップと画像の取得
- 107mMのNaCl、7.2mMのKCl、さ1.2mmのMgCl 2、1mMのCaCl 2で 、11.5mMグルコース、0.1％ウシ血清アルブミン、および20mMのHEPES 7.2：イメージングソリューションで適切な画像処理室内にHeLa細胞をカバースリップを配置。我々の研究室は、InvitrogenからAttofluorセルチャンバーを使用しています。倒立顕微鏡のステージでのイメージングチャンバーをマウントします。
- 40倍（またはそれ以上）油浸対物レンズを使用して、レシオメトリックpericamを表現する一つ以上の細胞を含む関心領域を見つける。我々は、レシオメトリックpericamは380 nmで光退色の少ない使用環境の良好であることを発見したため、我々は、適切なセルを識別するために、この波長を使用してください。図1で取得した画像については、1.3開口数とニコンSuperfluor 40X目的が使用されました。より高い倍率の目標でも（60〜100倍）が適切です。とD495/10（495 + / - 5 nmの） - 使用される励起フィルターはクロマテクノロジーフィルタD380/30x（30nmの380 + /）だった、ビームスプリッタは505DCXR（505nmロングパス）であり、発光フィルターはHQ535/50m（535 + / gであった。 - 25nmの）。
図1の画像を取得するために使用される私たちの顕微鏡は、ローパーサイエンティフィックCoolsnap HQはCCDカメラ、Ludl MAC6000急速なフィルターホイールとチェンジャー、およびMetaFluorデータ収集と解析ソフトウェアを冷却を装備したニコンTE2000倒立顕微鏡で構成されています。このプロトコルは、適切なフィルタとレシオメトリック画像をキャプチャし、処理することができるソフトウェアで、標準的な広視野顕微鏡に適合させることができます。 - 495および380nmのフィルターを用いて二重励起するためのソフトウェアをセットアップします。レシオメトリックpericamに結合カルシウムは495nmの吸光度を増加させる、従って比は495 nm/380 nmとするように設定する必要があります。
レシオメトリックpericamは、415 nmの4のカルシウムフリー励起ピークを持っています。このプロトコルでは、それはほとんどのカルシウムイメージングの研究室でユビキタスなので、唯一のフィルター380nmのを使用することをお勧めします。 410nmのフィルターが使用可能な場合、それは、380nmのフィルターに好適である。 - 495および380nmで連続してで交互に刺激的な画像を取得する。灌流装置を介してアゴニストのアプリケーションの前に少なくとも30秒間のベースラインのカルシウム濃度の画像を取得する。各アゴニストの添加時間をマークします。露光時間と取得間隔がまだ十分な時間的resolution.Forの例を可能にしながら退色を防止するために最適化されるべきである、アゴニスト刺激に応答して、監視半迅速なカルシウム動態のため、画像は図1BとCのはるかに高速アクイジションレートで2秒ごとに取得したまた、6可能です。スタウロスポリンの投与後の長期的なイメージングは、買収（図1 DとE）の間に長い間隔（30秒）で買収された。
3。画像処理と解析
- 実験が完了したら、得られた画像は、オフラインで分析することができます。あなたがカルシウム濃度の変化を監視するには、関心領域（ROI）を定義します。必要に応じてバックグラウンドを減算するフィールドの空の領域内で選択されたROIを使用してください。それは、ミトコンドリアが非常に運動性および動的であり、長期間にわたって、単一のミトコンドリア内のイベントを外挿することは常に可能ではないことに注意する必要があります。このように、いくつかの細胞型におけるこのオルガネラの高い運動性を考慮し、ROIの選択は慎重に監視する必要があります。さらに、図1、様々な刺激に対する不均一にミトコンドリア応答で証明。データをオフラインで分析し、フレームごとにRO1の配置を監視することが重要です。非常に運動性のミトコンドリアでミトコンドリアのカルシウムを測定するの詳細な説明は別の場所で7に記載されています。
- ROIから得られる比測定は、Excelまたは類似のgraphingsoftwareにインポートすることができます。データは、単一細胞または単一ミトコンドリアにおけるミトコンドリア内カルシウム濃度の変化を表すトレースとして表示、またはflを平均化することができます。複数のROIからuorescence信号。我々はまた、Fasリガンド8で誘導されるアポトーシスを起こしたリンパ球の集団における平均的なミトコンドリアのカルシウム濃度を測定するためにこのテクニックを使用している。
4。代表的な結果：
図1。レシオメトリック- pericam - MTの（A）細胞内局在。この最初のイメージは、レシオメトリック- pericam - mtを表現するライブHeLa細胞を示しています。番目のイメージはミトコンドリア選択性色素のMitoTrackerにより赤CMXRosと蛍光染色を示す。マージされた画像で黄色の蛍光は、レシオメトリック- pericam - MTおよびMitoTrackerの蛍光の共局在を示しています。（B）は、擬似カラーの比（495:380 nm）を10 mMのATPで処理MT -レシオメトリックpericamを表現する4 HeLa細胞の一連の画像（C）関心領域（ROI）のミトコンドリア内カルシウム濃度の変化の定量化は、擬似の比（495:380 nm）のmtを発現するHeLa細胞の画像の（B）10 mMのATPによる治療を受けた。（D）シリーズに示さレシオメトリックpericamは0.5μMスタウロスポリンで処理した。個々のミトコンドリアのカルシウム応答の不均一性は明らか、と同様に60分でミトコンドリアの重要な断片化です。他のカルシウムのレベルに著しい変動があった場合（黄色の矢印の頭を）表示されないのに対し、いくつかのミトコンドリアは、カルシウム（白い矢印の頭）の振動が増加している。とアポトーシスの誘導後に単一のHeLa細胞におけるグローバルミトコンドリア内カルシウム濃度の増加（E）定量0.5μMのスタウロスポリン。
Discussion
ここでは、ミトコンドリアをターゲットとしたレシオメトリックpericamを使用してミトコンドリアのカルシウムを測定するための非常にシンプルな方法を提示する。表示しないようにデコンボリューションで標準的な広視野の光学系を用いて、図1Aに示すように、それは容易に許容可能な信号対雑音比でHeLa細胞に個々のミトコンドリアを表示することが可能です。共焦点顕微鏡やその他の特殊な装置を不要にするときに接着HeLa細胞は、培養中のほとんどの細胞と同様に、著しく平坦化されるためです。我々は、ポリ-リジンコートしたカバースリップ8に付着したJurkat細胞で同様の結果を発見した。染料を使用しての方法論とは対照的に、それは非侵襲的にレシオメトリックpericam（図1E）などの遺伝的に符号化されたカルシウムの指標を用いて時間のミトコンドリア内カルシウム濃度を監視することも可能です。細胞死の間にミトコンドリアのカルシウムを分析するときに特に重要です。さらに、アポトーシス過程でミトコンドリアの分裂/断片化を視覚化することも可能です。図1DおよびEに示すように、スタウロスポリン処理は20分でのミトコンドリアのピークの選択部分母集団におけるカルシウムでゆっくりと増加を引き起こす。カルシウム濃度は、再び2時間処理した後に再び行く前にミトコンドリアの断片化との併用下に行く。これは、フラ-2 9を用いて測定したスタウロスポリン処理による細胞内カルシウムの徐波と一致している。したがって、重要な運動情報は静的な測定を用いる方法では不可能である得ることができます。我々は比と図1のないカルシウム濃度を示してきたが、それは絶対的なカルシウムレベル4、10を計算するためにその場でセンサーを校正することが可能です。考慮すべき重要な注意事項は、レシオメトリックpericamは、pH 4、10に敏感であることです。細胞質とミトコンドリアの両方のpHレベルは、アポトーシス11で劇的に変えることができるように、これは重要な考慮事項です。単離されたミトコンドリアに発現pericamにおけるpHの滴定は示してその増加して[H +]が増加するの410nmでの励起、同時にミトコンドリアのカルシウムの両方を測定するために悪用されているプロパティによって誘導放出にほとんど影響で、495 nmで励起したpericamの排出量とpHは12。従って、選択的に410 nm励起での発光を監視することはpHの低下懸念と非レシオメトリックモニターミトコンドリアカルシウムする手段を提供します。最後に、ここで紹介するプロトコルではこのように、ほとんどの研究室へのこの技術にアクセスできるように、広く利用可能なフィルタを使用して標準落射蛍光顕微鏡にアクセスする必要があります。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
我々は、レシオメトリック- pericam - MT発現構築物を弊社に提供するための宮脇敦史に感謝します。この作品は、国立衛生研究所（DB）からの助成金GM081685によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted wide-field fluorescent calcium imaging microscope | Nikon Instruments | MEA53310 | Any wide-field inverted microscope equipped with 380 nm/495 nm excitation filters and appropriate longpass and emission filter can be easily adapted to use this protocol. |
| Imaging Software | Molecular Devices | Metafluor | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A-7816 | Any imaging chamber for an inverted microscope which allows perfusion would suffice. |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Most transfection reagents/protocols would be appropriate for these studies |
| MitoTracker Red CMXRos | Invitrogen | M7512 |
References
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