Bu protokol, mitokondriyal kalsiyum akıları floresan görüntüleme ile gerçek zamanlı ölçümü için bir yöntem açıklanır. Yöntemi seçici mitokondri ifade dairesel permutated bir çift uyarma YFP tabanlı oranlı metrik kalsiyum sensör (oranlı metrik pericam-mt) yararlanır.
Çeşitli uyaranlara yanıt olarak hücre içi kalsiyum konsantrasyonu Dinamik değişiklikler, proliferasyon, diferansiyasyon ve apoptosis 1 gibi birçok hücresel süreçleri düzenler. Mitokondri, kalsiyum birikimi apoptozis sırasında serbest pro-apoptotik faktörlerin sitoplazmada 2 içine mitokondri teşvik etmektedir. Bu nedenle, doğrudan canlı hücrelerde apoptozis sırasında in situ mitokondriyal kalsiyum ölçmek için ilgi . Yüksek çözünürlüklü floresan görüntüleme çift uyarma oranlı metrik ve oranlı metrik olmayan sentetik kalsiyum gösterge boya ile yüklü hücreler, hücre içi kalsiyum sinyal çeşitli yönlerini incelemek için güvenilir ve çok yönlü bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Sitozolik kalsiyum akıları ölçerek, bu teknikleri kullanarak oldukça basittir. Ancak, rhod-2 ve rhod-FF gibi sentetik kalsiyum göstergeleri kullanarak sağlam hücreler intramitochondrial kalsiyum seviyelerini ölçmek daha zor. Mitokondri hedeflenen Sentetik göstergeleri mitokondriyal kalsiyum tekrarlayan artar yanıtları köreldiğini ve mitokondriyal morfolojisi 3 bozabilir. Ayrıca, sentetik göstergeler, uzun vadeli denemeler için uygunsuz hale getiren birkaç saat içinde mitokondri sızıntısı eğilimindedir. Böylece, mitokondriye hedefleyen yeşil floresan protein (GFP) 4 veya aequorin 5 dayalı genetik olarak kodlanmış olan kalsiyum göstergeleri, mitokondriyal kalsiyum dinamikleri ölçümü önemli ölçüde kolaylaştırmıştır. Burada, farklı uyaranlara tepki olarak mitokondriyal kalsiyum akıları gerçek zamanlı ölçümü için basit bir yöntem açıklanmaktadır. Seçici mitokondri hedeflenen 'oranlı metrik pericam' floresan mikroskopi yöntemi dayanıyor. Oranlı metrik pericam dairesel karılmış sarı floresan protein ve kalmodulin 4 bir füzyon dayalı bir kalsiyum göstergesi. Oranlı metrik pericam kalsiyum bağlayıcı emisyon spektrumu, yaklaşık 515 nm zirveleri, değişmeden kalırken, 415 nm ile 494 nm eksitasyon zirve kaymasına neden olur. Oranlı metrik pericam ~ 1.7 mcM 4 in vitro sabit bir disosiasyon tek bir kalsiyum iyonu bağlar. Oranlı metrik pericam Bu özellikler, mitokondriyal kalsiyum konsantrasyonu hızlı ve uzun vadeli değişimler miktarının izin verir. Ayrıca, bu metodoloji, yaygın olarak kullanılan filtre setleri ile standart bir geniş alan kalsiyum görüntüleme mikroskop adaptasyonu açıklar. Iki ayrı agonistleri purinerjik agonist ATP ve apoptozis indükleyici ilaç staurosporine kullanarak, saat saniye zamansal çözünürlüğe sahip mitokondriyal kalsiyum konsantrasyonu değişiklikleri izlemek için bu yöntem uygun olduğunu göstermektedir. Ayrıca, biz de oranlı metrik pericam apoptozis sırasında mitokondrial fizyon / parçalanma ölçmek için de yararlı olduğunu göstermektedir. Böylece, özellikle de oranlı metrik pericam apoptozis sırasında mitokondriyal kalsiyum dinamikleri sürekli uzun vadeli ölçümü için uygundur.
Burada mitokondriyal hedefli oranlı metrik pericam kullanarak mitokondriyal kalsiyum ölçmek için çok basit bir yöntem mevcut. Olarak kabul edilebilir sinyal-gürültü oranı ile kolayca HeLa hücreleri bireysel mitokondri görmek mümkündür, hiçbir deconvolution standart widefield optiği kullanarak, Şekil 1A gösterilmiştir. Bu zaman yapışık konfokal mikroskopi veya diğer özel ekipman için gerek kalmayabilir HeLa hücrelerinde, kültür hücreleri gibi, önemli ölçüde düzleştirmek çünkü. Biz poli-lizin kaplı lamelleri 8 yapıştırılır Jurkat hücrelerinde benzer sonuçlar bulduk. Boyalar kullanarak metodolojileri aksine, non-invaziv oranlı metrik pericam (Şekil 1E) gibi genetik olarak kodlanmış olan kalsiyum göstergeleri kullanarak saat mitokondriyal kalsiyum düzeylerinin izlenmesi de mümkündür. Hücre ölümü sırasında mitokondriyal kalsiyum analiz ederken bu özellikle önemlidir. Ayrıca, apoptotik süreci sırasında fisyon / mitokondri parçalanması görselleştirmek için de mümkündür. Şekil 1D ve E görüldüğü gibi, staurosporine tedavi, 20 dakika mitokondri hangi doruklarına seçin alt popülasyonlar kalsiyum yavaş bir artışa neden olur. Kalsiyum düzeyleri tedavi 2 saat sonra tekrar gitmeden önce tekrar mitokondriyal parçalanma ile eş zamanlı aşağı gidin. Bu Fura-2 9 kullanarak ölçülen staurosporine tedavi ile indüklenen sitozolik kalsiyum yavaş dalgaları ile tutarlıdır. Böylece, önemli kinetik bilgiler statik ölçümler istihdam yöntemleri ile mümkün değildir elde edilebilir. Oranları ve kalsiyum konsantrasyonları Şekil 1'de sunulan olmasına rağmen, mutlak kalsiyum düzeyleri 4, 10 hesaplamak için in situ sensörü kalibre etmek mümkündür. Dikkate alınması gereken önemli bir ihtar oranlı metrik pericam pH 4, 10 duyarlı olmasıdır . Hem sitozolik ve mitokondriyal pH seviyeleri apoptozis 11 sırasında dramatik bir biçimde değiştirebilir, bu önemli bir husustur. Izole mitokondri ifade pericam pH Titrasyon göstermek artan [H +] 410 nm eksitasyon, aynı anda hem mitokondriyal kalsiyum ölçmek için kullanılabilir bir özellik tarafından uyarılmış emisyon üzerinde çok az etkisi ile artar, 495 nm'de heyecan pericam emisyon ve pH 12. Böylece, seçici 410 nm eksitasyon emisyon izleme için daha az endişe ile pH olmayan ratiometrically monitör mitokondriyal kalsiyum için bir araç sağlar. Son olarak, burada sunulan protokol, böylece bu tekniği en laboratuarlara erişilebilir hale yaygın kullanılan filtreler ile standart bir epifluorescent mikroskop erişim gerektirir.
The authors have nothing to disclose.
Biz Atsushi Miyawaki oranlı metrik pericam mt ifade inşa bize sağladığı için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (DB) hibe GM081685 tarafından da desteklenmiştir.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Inverted wide-field fluorescent calcium imaging microscope | Nikon | MEA53310 | Any wide-field inverted microscope equipped with 380 nm/495 nm excitation filters and appropriate longpass and emission filter can be easily adapted to use this protocol. | |
Imaging Software | Molecular Devices, Inc | Metafluor | ||
Attofluor cell chamber | Invitrogen Corporation | A-7816 | Any imaging chamber for an inverted microscope which allows perfusion would suffice. | |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen Corporation | 11668-019 | Most transfection reagents/protocols would be appropriate for these studies | |
MitoTracker Red CMXRos | Invitrogen Corporation | M7512 |