פרוטוקול זה מתאר שיטה למדידת זמן אמת של והנתיבים סידן המיטוכונדריה ידי דימות פלואורסצנטי. השיטה מנצלת את חיישן YFP מבוססי permutated מעגלית סידן עירור כפול ratiometric (ratiometric pericam-MT) הביע סלקטיבי במיטוכונדריה.
שינויים דינאמיים בריכוז סידן תוך תאי בתגובה לגירויים שונים מווסת תהליכים תאיים רבים, כגון ריבוי, התמיינות, אפופטוזיס ו 1. במהלך הצטברות סידן, אפופטוזיס במיטוכונדריה מקדמת את שחרורו של תומכי אפופטוטיים גורמים מן המיטוכונדריה לתוך 2 cytosol. לכן זה עניין למדוד ישירות סידן המיטוכונדריה בתאים חיים באתרו במהלך אפופטוזיס. ברזולוציה גבוהה דימות פלואורסצנטי של תאים עמוסה עירור כפול ratiometric ולא ratiometric צבעים אינדיקטור סינתטי סידן הוכח להיות כלי אמין צדדי ללמוד היבטים שונים של סידן איתות תאיים. מדידת והנתיבים סידן cytosolic באמצעות טכניקות אלה היא פשוטה יחסית. עם זאת, מדידת רמות סידן intramitochondrial בתאים שלמים באינדיקטורים סידן סינטטי כגון rhod-2 ו-FF rhod הוא יותר מאתגר. האינדיקטורים סינתטי ממוקד המיטוכונדריה הקהו התגובות מגביר חוזרות בסידן המיטוכונדריה, ולשבש מורפולוגיה המיטוכונדריה 3. בנוסף, האינדיקטורים סינתטיים נוטים לדלוף החוצה של המיטוכונדריה על כמה שעות מה שהופך אותם מתאימים לטווח ארוך ניסויים. לכן, האינדיקטורים סידן מקודדים גנטית מבוססת על הפלואורסצנט הירוק (GFP) חלבון 4 או 5 aequorin ממוקד המיטוכונדריה הקלו מאוד מדידת דינמיקה סידן המיטוכונדריה. כאן אנו מתארים שיטה פשוטה למדידת זמן אמת של והנתיבים סידן המיטוכונדריה בתגובה לגירויים שונים. השיטה מבוססת על מיקרוסקופ פלואורסצנטי של "ratiometric-pericam" אשר מיועד סלקטיבי המיטוכונדריה. Pericam Ratiometric הוא אינדיקטור סידן על בסיס היתוך של חלבון permuted מעגלית ניאון צהוב calmodulin 4. עקידת סידן pericam ratiometric גורמת לשינוי של שיא עירור שלה nm 415-494 ננומטר, בעוד ספקטרום פליטה, אשר פסגות סביב 515 ננומטר, נשאר ללא שינוי. Ratiometric pericam נקשר יון סידן אחד עם ניתוק קבוע במבחנה של 1.7 מיקרומטר ~ 4. אלה המאפיינים של pericam ratiometric לאפשר כימות של שינויים מהירים לטווח ארוך בריכוז הסידן המיטוכונדריה. יתר על כן, אנו מתארים הסתגלות של מתודולוגיה זו מיקרוסקופ סידן תקן רחב בתחום ההדמיה עם מערכות הסינון זמין בדרך כלל. השימוש בשתי אגוניסטים ברורים, אגוניסט ATP purinergic ו אפופטוזיס וישכנע staurosporine התרופה, אנו מוכיחים כי שיטה זו היא המתאימה לניטור שינויים בריכוז הסידן המיטוכונדריה עם רזולוציה הזמני של שניות שעות. יתר על כן, אנחנו גם מראים כי pericam ratiometric שימושית גם עבור ביקוע מדידת הפיצול המיטוכונדריה / במהלך אפופטוזיס. לפיכך, pericam ratiometric הוא גם מתאים במיוחד למדידת לטווח ארוך מתמשך של הדינמיקה סידן המיטוכונדריה במהלך אפופטוזיס.
כאן אנו מציגים שיטה מאוד פשוטה למדידת סידן המיטוכונדריה באמצעות המיטוכונדריה במיקוד pericam ratiometric. כפי שניתן לראות בתרשים 1 א ', באמצעות תקן widefield אופטיקה עם deconvolution לא ניתן להציג בקלות את המיטוכונדריה בתאים בודדים הלה עם יחס אות לרעש מקובל. הסיבה לכך היא כי תאים הלה, כמו רוב התאים בתרבית, מחוץ לשטח באופן משמעותי כאשר חסיד obviating את הצורך מיקרוסקופיה confocal או ציוד מיוחד אחר. מצאנו תוצאות דומות בתאים Jurkat דבק poly-ליזין coverslips מצופה 8. בניגוד מתודולוגיות באמצעות צבעים, אותו ניתן גם הלא פולשני לעקוב אחר רמות סידן המיטוכונדריה שעות באינדיקטורים סידן מקודדים גנטית כגון pericam ratiometric (איור 1E). זה חשוב במיוחד בעת ניתוח סידן המיטוכונדריה במהלך מוות של תאים. יתר על כן, אפשר גם לדמיין ביקוע / פיצול של המיטוכונדריה במהלך תהליך אפופטוטיים. כפי שמוצג 1D דמויות ו-E, טיפול staurosporine גורמת לעלייה איטית סידן subpopulations לבחור מתוכם פסגות המיטוכונדריה ב 20 דקות. רמות סידן לרדת שוב במקביל עם פיצול המיטוכונדריה לפני הולך שוב 2 שעות לאחר הטיפול. זה עולה בקנה אחד עם גלים איטיים בסידן cytosolic המושרה על ידי טיפול staurosporine שנמדדו באמצעות Fura-2 9. לפיכך, מידע חשוב הקינטית ניתן להשיג דבר שאינו אפשרי עם שיטות העסקת מדידות סטטי. למרות הצגנו יחסי ולא ריכוזי הסידן באיור 1, ניתן לכייל את החיישן באתרו לחשב רמות הסידן מוחלט 4, 10. אזהרה אחת חשובה שיש לקחת בחשבון הוא כי pericam ratiometric רגיש pH 4, 10. כמו גם רמות ה-pH cytosolic ואת המיטוכונדריה יכולה להשתנות באופן דרמטי במהלך 11 אפופטוזיס, זה שיקול חשוב. טיטרציה של pH ב pericam מבודד להביע המיטוכונדריה להוכיח כי הגדלת [H +] מגדיל פליטת pericam כאשר נרגש ב 495 ננומטר, עם השפעה מועטה על פליטה מאולצת על ידי עירור ב 410 ננומטר, מאפיין אשר נוצל למדוד בו זמנית הן סידן המיטוכונדריה ו pH 12. לכן, באופן סלקטיבי ניטור פליטה עם עירור 410 ננומטר מספק אמצעי סידן שאינם ratiometrically לפקח המיטוכונדריה בדאגה מופחת עבור ה-pH. לבסוף, את הפרוטוקול המוצגים כאן רק מחייב גישה מיקרוסקופ epifluorescent סטנדרטי עם מסנני זמינים באופן נרחב, ובכך טכניקה זו נגישה ביותר במעבדות.
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להודות Atsushi מיאווקי לספק לנו לבנות ratiometric-pericam-MT הביטוי. עבודה זו נתמכה על ידי מענק GM081685 מן המכונים הלאומיים לבריאות (DB).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Inverted wide-field fluorescent calcium imaging microscope | Nikon | MEA53310 | Any wide-field inverted microscope equipped with 380 nm/495 nm excitation filters and appropriate longpass and emission filter can be easily adapted to use this protocol. | |
Imaging Software | Molecular Devices, Inc | Metafluor | ||
Attofluor cell chamber | Invitrogen Corporation | A-7816 | Any imaging chamber for an inverted microscope which allows perfusion would suffice. | |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen Corporation | 11668-019 | Most transfection reagents/protocols would be appropriate for these studies | |
MitoTracker Red CMXRos | Invitrogen Corporation | M7512 |