Summary
運動は免疫細胞にアポトーシスを誘導することが可能です。様々な測定の制限は特に事前評価への血液サンプルを分離し、治療に必要な時間の量に関連する、があります。が示され、運動誘発性リンパ球アポトーシスの解析のための迅速かつ低侵襲です。
Abstract
運動は免疫細胞にアポトーシスを誘導可能な生理的刺激です。これまでに、様々な制限は特に事前の細胞死の評価に血液サンプルを分離し、治療に必要な時間の量に関連する、この現象の計測と同定されている。このため、それは免疫細胞のアポトーシスに報告された増加は、システム上の運動の実際の効果に貢献し、または時間と最終的にこの測定を得るために必要な処理の反射であることができるかどうかを判断するのは困難である。この記事では、運動誘発性リンパ球のアポトーシスの解析のための迅速かつ低侵襲の手順を示しています。他の技術とは異なり、全血は検体を入手した時点で直ちに抗体のパネルに追加されます。潜伏期間の後、赤血球を溶解し、試料は、分析する準備が整いましたされています。指先穿刺のサンプリング手順の使用は、必要な血液量が減少し、被験者に不快感を最小限に抑えることができます。
Protocol
1。フィンガースティック採血
- 全血のコレクションは、通常、ベースラインの測定（通常10〜15分座って休息の後）のため、運動では、次の中や直後、および運動後の期間を通じて安静時に取得されます（一般的には1-3時間からの停止後運動）。
- 普遍的予防策を使用して、最初の70％イソプロピルアルコールで指先を消毒する。
- 次に、穿刺自動化されたランセットまたは類似のデバイスを使用してサイト。我々は被験者の快適さを提供するために30ゲージのランセットを使用していますが、より大きなゲージの針を利用することができます。
- 血液の最初のドロップを拭き取りますし、凝固を防ぐためにリチウムヘパリン処理毛細管またはmicrovettesに血液を集める。
2。細胞の表現型およびアポトーシスの染色
- 250μL結合バッファーでtitred抗体のパネル（表1の回路図を参照）に10μLヘパリン加全血を追加。我々は成功で1:20の希釈率を使用しましたが、各研究室では、最高の実用的なソリューションを決定するために、その試薬を力価してください。
白血球サブセットにおける運動誘発性アポトーシスの決定のための表1。抗体パネル。後期のアポトーシスをアネキシンVと7 - AADとの二重陽性標識によって定義されている間早期のアポトーシスは、アネキシンVの式によって定義されました。壊死細胞は、唯一のアネキシンV -および7 - AAD +細胞であった。チューブ1 チューブ2 チューブ3 チューブ4 細胞のみ管 アネキシンV - FITC アネキシンV - FITC アネキシンV - FITC 抗ヒトCD4 - PE 抗ヒトCD8 - PE 抗ヒトCD19 - PE 7 - AAD 7 - AAD 7 - AAD 抗ヒトCD45RA - APC 抗ヒトCD45RA - APC
7 - AAD = 7 - アミノアクチノマイシンD、APC =アロフィコシアニン、CD4 =ヘルパーTリンパ球、CD8 =細胞傷害性/抑制性Tリンパ球、CD19 = Bリンパ球、CD45RA =ナイーブ細胞サブセット、FITC =フルオレセインイソチオシアネート、PE =フィコエリスリン。 - 30分間暗所で室温でインキュベートする。
- 5〜10分間1075 × gで遠心する。
- デカントは、300μL赤血球溶解バッファーを追加し、徹底的にボルテックス。
- 室温で15分間インキュベートする。
- 赤血球溶解反応を停止するには300μLのPBSを追加。
- 5〜10分間1075 × gで遠心する。
- デカント、ラック、および50μLの結合バッファーを加える。
- フローサイトメトリーにより分析する。
それは最低限、次のコントロールを利用することが推奨されます：バックグラウンドの自家蛍光を検出するのネガティブコントロールとして機能するだけチューブセル、および個々の入ったチューブは、フローサイトメーターのセットアップ、最初の時の補償を設定するには、蛍光色素。さらに、我々の実験を設定するには成功報酬の標準ビーズを使用している。
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Discussion
低侵襲サンプルの収集手順とその後の分析は、運動誘発性のリンパ球のアポトーシスの初期および後期段階の両方の分析のために示されている。それは明らかに壊死、およびアポトーシスとなっていない細胞を、除外することも可能です。この手順では、中、および直後に運動した後、前に、複数の時点での肘前部からの侵襲的な静脈穿刺に伴う欠点や不快感を克服し、または運動の期間中、カテーテルを確保する。調査官の面では、このような手順は、通常ではない、すべての個人が持っている瀉血療法の専門訓練を、必要とする。さらに、被験者募集および保存は、1つが存在する場合には有意な効果を見つけることの潜在的な統計的検出力を増加させるので、この手順を使用して拡張される予定です。
静脈穿刺採血を採用した従来の研究では、全体的なリンパ球のために安静時と運動後の値を報告している。アネキシンV、シンプソンらを。活用することで安静時の約1.2％アポトーシスリンパ球を報告し、そして〜1.3％以下のトレッドミルは、1を実行している。同様に、Steensberg らは 2を実行して 2.5時間後に約1.8％の合計アポトーシス安静時のリンパ球、および約2.1％と報告。指先穿刺の手順ここで説明を使用してアポトーシスリンパ球のための我々の結果は0.7で、似ていますが± 0.2、安静時に観察％、および1.1 ± 0.4％段階的運動負荷試験（未発表の結果を）完成した5人の被験者の運動後に。
運動誘発性の免疫細胞死を決定するために使用される以前の方法論の限界の一つは、血液サンプルを処理するために必要な時間だった。以前の調査では、サンプルは最終的に細胞死3〜5の評価される前に（2時間限り）長い分離と準備プロセスに供した静脈穿刺によってすぐに運動後に得られた。それは、そのような処理の遅延が人為的に報告された運動後のリンパ球のアポトーシスの値を高める可能性があることを推測するのが妥当である。いくつかのケースでは、アネキシンV陽性リンパ球は〜25％6のように高いことが報告されている。この方法論的交絡因子のさらなる解釈は、リンパ球アポトーシスに対して報告された値は、運動や血液の処理の遅延によるものであったかどうかの問題を発生させます。我々はその前の方法論が正確に運動が7免疫細胞に細胞死を誘導に与える影響を反映していないが示唆された。
ここに示した方法論を利用すると、各コレクションの時点で必要な血液量が減少。また、我々のアプローチは、リンパ球アポトーシスのための偽陽性の発生率を減少させる可能性がある、サンプル処理時間が短縮されます。このプロトコルでは、全血は、このようにリンパ球アポトーシスのプロセスを通じて、進歩とは前に抗体染色に排除されている可能性を減らすこと、採血後30秒以内に抗体のパネルに追加されます。この手順は、前述の測定の限界を克服し、そして生理的刺激などの運動によって誘発されるアポトーシスリンパ球の定量化が可能になります。この方法論に関して持つ将来の研究では、より大きなゲージのランセットの潜在的な違いを評価する必要があります。
さらに、このホワイトペーパーで説明されている方法論は、リンパ球サブセットにおける運動誘発性アポトーシス（表1参照）の早期と後期両方のステージを決定することができます。アネキシンVと7 - AADとの二重染色は、後者の段階に細胞死のプロセスを介して進行を示すのに対し、アネキシンVで染色された細胞は、唯一、アポトーシスの初期段階にある。単独で7 - AADでマークされた細胞は壊死による細胞死を受けていることを示しています。リンパ球の表現型は、分化マーカーのクラスタを介して行う（CD4は=ヘルパーTリンパ球、CD8 = T -リンパ球抑制/細胞傷害性、CD45RA =ナイーブ亜分画、CD19 = B -リンパ球）。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この研究は、ケンタッキー州西部大学の学部奨学金委員会から新学部のグラントによってサポートされていました。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow Cytometry Binding Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | ||
| RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4333-57 | ||
| Lancet Device | Accu Check Soft Touch | Roche Group | ||
| Capillary tubes | Heparinized Capillary Tubes | Chase Scientific Glass, Inc. | 501 | |
| Centrifuge | GmC Lab | Gilson, Inc. | PMS-880 | |
| Annexin V-FITC Conjugated | Biovision Inc. | K201-400-1 | ||
| CD4-PE Conjugated | Anti-human, clone RPA-T4 | eBioscience | 12-0049-42 | |
| CD8-PE Conjugated | Anti-human, clone OKT8 | eBioscience | 12-0086-73 | |
| CD19-PE Conjugated | Anti-human, clone HIB19 | eBioscience | 12-0199-42 | |
| 7-AAD Viability Staining Solution | eBioscience | 00-6993-50 | ||
| CD45RA-APC Conjugated | Anti-human, clone HI100 | eBioscience | 17-0458-42 | |
| Flow cytometer | C6 | Accuri |
References
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