Summary
ممارسة قادر على إحداث موت الخلايا المبرمج في الخلايا المناعية. هناك حدود القياس المختلفة ، لا سيما فيما يتصل مقدار الوقت اللازم لعزل ومعالجة عينة من الدم قبل التقييم. تظاهر هو إجراء سريع ومينيملي لتحليل ممارسة النشاط الخلايا اللمفاوية.
Abstract
هو ممارسة التحفيز الفسيولوجية قادرة على إحداث موت الخلايا المبرمج في الخلايا المناعية. حتى الآن ، وقد تم تحديد أوجه القصور المختلفة مع قياس هذه الظاهرة ، لا سيما فيما يتصل مقدار الوقت اللازم لعزل ومعالجة عينة من الدم قبل تقييم موت الخلايا. وبسبب هذا ، فمن الصعب تحديد ما إذا كان يمكن ساهمت الزيادات التي أعلن عنها في موت الخلايا المبرمج للخلايا المناعية الأثر الفعلي لممارسة على النظام ، أو هي انعكاس للوقت وتجهيزها في نهاية المطاف من الضروري الحصول على هذا القياس. في هذه المقالة أن نبرهن إجراء سريع ومينيملي لتحليل ممارسة النشاط الخلايا اللمفاوية. خلافا لغيرها من التقنيات ، إضافة إلى الدم الكامل وحة الضد فور الحصول على العينة. بعد فترة الحضانة ، وlysed خلايا الدم الحمراء ومستعدون عينات لتحليلها. استخدام إجراء المعاينة الاصبع العصا يقلل من حجم الدم المطلوبة ، ويقلل من عدم الراحة لمواضيع.
Protocol
1. الإصبع عصا الدم أخذ العينات
- عادة ما يتم اتخاذ مجموعة من الدم الكامل في بقية لقياس خط الأساس (عادة بعد 10-15 دقيقة بقية الجذور) ، أثناء أو بعد المباراة على الفور وممارسة ، وطوال فترة ما بعد العملية (عادة من 1-3 ساعات بعد وقف ممارسة الرياضة).
- باستخدام الاحتياطات العالمي ، تعقيم لأول مرة مع الإصبع ايزوبروبيل 70 ٪.
- المقبل ، ثقب موقع باستخدام مشرط الآلي أو جهاز مماثل. على الرغم من أننا استخدام مشرط عيار 30 لتوفير الراحة للموضوع ، يمكن استخدام إبرة أكبر قياس.
- يمسح أول قطرة من الدم ، ومن ثم جمع الدم في أنابيب أو الشعرية microvettes تعامل مع الهيبارين لمنع تخثر الليثيوم.
2. Phenotyping الخلية وموت الخلايا المبرمج يلطخ
- أضف 10 ميكرولتر من الدم الكامل heparinized إلى لوحة الضد titred في المخزن 250 ملزم ميكرولتر (انظر الجدول 1 التخطيطي). وقد استخدمنا عامل إضعاف 01:20 مع النجاح ، ولكن ينبغي لكل مختبر عيار الكواشف لتحديد الحل الأفضل العمل.
لوحة جسم الجدول 1. لتحديد ممارسة النشاط موت الخلايا المبرمج في مجموعات فرعية الكريات البيض. وقد تم تعريف الخلايا في وقت مبكر عن طريق التعبير عن Annexin الخامس ، في حين تم تحديد الخلايا في وقت متأخر عن طريق وضع العلامات الايجابية مزدوجة مع Annexin V و 7 AAD. وكانت الخلايا نخرية Annexin V - 7 - وAAD + الخلايا فقط.أنبوب 1 أنبوب 2 أنبوب 3 أنبوب 4 خلايا أنبوب فقط Annexin V -- FITC Annexin V -- FITC Annexin V -- FITC الإنسان CD4 المضادة -- PE CD8 المضادة البشرية -- PE مكافحة الإنسان CD19 -- PE 7 - AAD 7 - AAD 7 - AAD CD45RA المضادة البشرية -- APC CD45RA المضادة البشرية -- APC
7 - 7 - AAD = أمينية أكتينوميسين D ، APC = Allophycocyanin ، CD4 = مساعد الخلايا اللمفية تي ، CD8 = الخلايا اللمفية تي القامع / السامة للخلايا ، CD19 = باء الخلايا اللمفية ، CD45RA خلية ساذجة = فرعية ، FITC ثيوسيانات فلوريسئين = = PE فيكوإيريترين. - يحضن في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 30 دقيقة.
- الطرد المركزي في 1075 x ج لمدة 5-10 دقائق.
- صب ، إضافة 300 ميكرولتر خلايا الدم الحمراء الاحتياطي تحلل ، وتماما الدوامة.
- يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
- إضافة 300 ميكرولتر لوقف برنامج تلفزيوني RBC تفاعل تحلل.
- الطرد المركزي في 1075 x ج لمدة 5-10 دقائق.
- صب ، رف ، وإضافة 50 ميكرولتر العازلة ملزمة.
- تحليل من قبل التدفق الخلوي.
فمن المستحسن أن كحد أدنى ، يمكن الاستفادة من الضوابط التالية : أ الخلايا أنبوب فقط لتكون بمثابة الشاهد السلبي في الكشف عن تألق ذاتي الخلفية ، والأنابيب التي تحتوي على كل فرد ملون تألقي لتعيين التعويض الأولي خلال إعداد للتدفق عداد الكريات. بالإضافة إلى ذلك ، فقد استخدمنا حبات معيار التعويض بنجاح لاقامة تجاربنا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وأظهر جمع العينات مينيملي الداخلي والتحليل اللاحق لتحليل كل من المراحل المبكرة والمتأخرة من ممارسة النشاط الخلايا اللمفاوية. ومن الممكن أيضا أن تستبعد بوضوح تلك الخلايا ، والتي هي نخرية ، وأفكارك لا. هذا الإجراء يتغلب على السلبيات وعدم الراحة المرتبطة بزل الوريد الغازية من المنطقة المرفقية في نقطة زمنية متعددة قبل وأثناء وبعد التمرين مباشرة ، أو تأمين قسطرة لمدة نوبة ممارسة الرياضة. حيث من المحققين ، مثل هذه الإجراءات عادة ما تتطلب تدريبا متخصصا في الفصد ، والتي لا يكون لجميع الأفراد. بالإضافة إلى ذلك ، يخضع التوظيف ويتوقع أن يكون الأداء المعزز باستخدام هذا الإجراء ، وبالتالي زيادة القدرة الإحصائية المحتملة لإيجاد تأثير كبير إذا كان موجودا.
وأفادت التحقيقات السابقة توظيف القيم بزل الوريد اخذ عينات من الدم أثناء الراحة ، وآخر من أجل ممارسة الخلايا الليمفاوية بشكل عام. استخدام annexin الخامس ، سيمبسون وآخرون. الخلايا الليمفاوية ذكرت أفكارك حوالي 1.2 ٪ في بقية ، و ~ مفرغه التالية 1.3 ٪ تشغيل 1. وبالمثل ، ذكرت Steensberg وآخرون. ~ 1.8 ٪ مجموع الخلايا اللمفاوية في بقية أفكارك ، وحوالي 2.1 ٪ بعد 2.5 ساعة من تشغيل 2. نتائجنا عن أفكارك الخلايا الليمفاوية باستخدام الإجراء الاصبع العصا الموصوفة هنا متشابهة ، مع 0.7 ± 0.2 ٪ لوحظ في بقية ، و 1.1 ± 0.4 ٪ بعد العملية في خمسة موضوعات الذين أتموا اختبار ممارسة متدرجة (نتائج غير منشورة).
كان واحدا من أوجه القصور في المنهجية المستخدمة لتحديد السابقة ممارسة النشاط موت الخلايا المناعية مقدار الوقت اللازم لتجهيز عينة الدم. في التحقيقات السابقة ، والحصول على عينات postexercise بزل الوريد على الفور وتعرض لعزلة طويلة وعملية إعداد (طالما ح 2) قبل أن يجري في نهاية المطاف المقررة للموت الخلية 3-5. فمن المعقول أن يتكهن بأن تأخير معالجة ما قد يرفع بشكل مصطنع عن موت الخلايا المبرمج لمفاوية بعد ممارسة القيم. في بعض الحالات ، تم الإبلاغ عن annexin اللمفاويات الخامس إيجابية لتكون عالية كما 25 ٪ ~ 6. مزيد من التفسير لهذه المنهجية المحير يثير مسألة ما إذا كانت القيم التي أبلغ عن موت الخلايا المبرمج لمفاوية كان من المقرر في ممارسة أو تأخير تجهيز الدم. اقترحنا أن المنهجية السابقة لم تعكس بدقة التأثير الذي يمارس على واستحثاث موت الخلية في الخلايا المناعية 7.
الاستفادة من منهجية أثبتت هنا يقلل من كمية الدم المطلوبة لجمع كل نقطة زمنية. أيضا ، نهجنا النقصان عينة تجهيز الوقت ، والتي قد تقلل من حدوث ايجابيات كاذبة عن موت الخلايا المبرمج لمفاوية. في هذا البروتوكول ، يضاف الدم كله إلى لوحة الأجسام المضادة في غضون ثوان - 30 بعد جمع الدم ، مما يقلل من احتمال أن يتم القضاء على الخلايا الليمفاوية من خلال عملية التقدم وأفكارك قبل تلوين الأجسام المضادة. هذا الإجراء يتغلب على حدود القياس التي نوقشت سابقا ، ويسمح لتقدير حجم الخلايا الليمفاوية أفكارك التي تسببها ممارسة كحافز الفسيولوجية. وينبغي دراسة في المستقبل فيما يتعلق بتقييم هذه المنهجية الخلافات المحتملة مع المشارط أكبر قياس.
بالإضافة إلى ذلك ، منهجية وصفها في هذه الورقة يسمح لتحديد المرحلة المبكرة والمتأخرة على حد سواء ممارسة النشاط في الخلايا اللمفاوية فرعية (انظر الجدول 1). خلايا ملطخة الخامس Annexin هي الوحيدة في المرحلة المبكرة من الخلايا ، في حين المزدوج مع تلوين الخامس Annexin و 7 - AAD تشير التقدم من خلال خلية عملية الإعدام إلى المراحل الأخيرة. الخلايا التي تحمل AAD - 7 وحدها تدل على موت الخلايا تمر عبر نخر. ويتم إنجاز Phenotyping من الخلايا الليمفاوية من خلال مجموعة من علامات التمايز (CD4 = مساعد اللمفاويات التائية ، CD8 = السامة للخلايا / القامع اللمفاويات التائية ، CD45RA = الأفخاذ السذاجة ، CD19 = الخلايا الليمفاوية B -).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا البحث من قبل منحة كلية جديدة من مجلس المنح الدراسية في كلية جامعة كنتاكي الغربية.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow Cytometry Binding Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | ||
| RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4333-57 | ||
| Lancet Device | Accu Check Soft Touch | Roche Group | ||
| Capillary tubes | Heparinized Capillary Tubes | Chase Scientific Glass, Inc. | 501 | |
| Centrifuge | GmC Lab | Gilson, Inc. | PMS-880 | |
| Annexin V-FITC Conjugated | Biovision Inc. | K201-400-1 | ||
| CD4-PE Conjugated | Anti-human, clone RPA-T4 | eBioscience | 12-0049-42 | |
| CD8-PE Conjugated | Anti-human, clone OKT8 | eBioscience | 12-0086-73 | |
| CD19-PE Conjugated | Anti-human, clone HIB19 | eBioscience | 12-0199-42 | |
| 7-AAD Viability Staining Solution | eBioscience | 00-6993-50 | ||
| CD45RA-APC Conjugated | Anti-human, clone HI100 | eBioscience | 17-0458-42 | |
| Flow cytometer | C6 | Accuri |
References
- Simpson, R. J., Florida-James, G. D., Whyte, G. P., Black, J. R., Ross, J. A., Guy, K. Apoptosis does not contribute to the blood lymphocytopenia observed after intensive and downhill treadmill running in humans. Res. Sports Med. 15, 157-174 (2007).
- Steensberg, A., Morrow, J., Toft, A. D., Bruunsgaard, H., Pedersen, B. K. Prolonged exercise, lymphocyte apoptosis and F2-isoprostanes. Eur. J. Appl. Physiol. 87, 38-42 (2002).
- Mooren, F. C., Bloming, D., Lechtermann, A., Lerch, M. M., Völker, K. Lymphocyte apoptosis after exhaustive and moderate exercise. J. Appl. Physiol. 93, 147-153 (2002).
- Peters, E. M., Eden, M. V. an, Tyler, N., Ramautar, A., Chutergoon, A. A. Prolonged exercise does not cause lymphocyte DNA damage or increased apoptosis in well-trained endurance athletes. Eur. J. Appl. Physiol. 98, 124-131 (2006).
- Wang, J. -S., Huang, Y. -H. Effects of exercise intensity on lymphocyte apoptosis induced by oxidative stress in men. Eur. J. Appl. Physiol. 95, 290-291 (2005).
- Mooren, F. C., Lechtermann, A., Völker, K. Exercise-induced apoptosis of lymphocytes depends on training status. Med. Sci. Sports Exerc. 36, 1476-1483 (2004).
- Navalta, J. W., Sedlock, D. A., Park, K. -S. Blood treatment influences the yield of apoptotic lymphocytes after maximal exercise. Med. Sci. Sports Exerc. 37, 369-373 (2005).
