Summary
תרגיל מסוגל גרימת מות תאים מתוכנת בתאי המערכת החיסונית. ישנן מגבלות מדידה שונים, בעיקר בנוגע לכמות הזמן הדרוש כדי לבודד ולטפל דגימת דם לפני האבחון. הפגינו הוא הליך מהיר פולשנית לניתוח אפופטוזיס האימון המושרה לימפוציטים.
Abstract
פעילות גופנית היא גירוי פיזיולוגי מסוגל גרימת מות תאים מתוכנת בתאי המערכת החיסונית. עד כה, מגבלות שונות זוהו עם המדידה של תופעה זו, במיוחד בנוגע למשך הזמן הנדרש כדי לבודד ולטפל דגימת דם לפני ההערכה של מוות של תאים. בגלל זה, קשה לקבוע האם עליות דיווח אפופטוזיס תא החיסון ניתן תרמו ההשפעה בפועל של פעילות גופנית על המערכת, או השתקפות של זמן עיבוד צורך בסופו של דבר להשיג את המדידה. במאמר זה אנו מדגימים הליך מהיר פולשנית לניתוח אפופטוזיס האימון המושרה לימפוציטים. שלא כמו טכניקות אחרות, דם כל מתווסף פאנל נוגדן מיד עם קבלת המדגם. לאחר תקופת הדגירה, כדוריות דם אדומות lysed דגימות מוכנים להיות מנותח. השימוש בנוהל אצבע מקל דגימה מקטין את נפח הדם הנדרש, מקטינה את אי נוחות לנבדקים.
Protocol
1. Finger-Stick דם דגימה
- איסוף דם נלקחת בדרך כלל כל למדידת קו בסיס (בדרך כלל לאחר 10-15 דקות מנוחה בישיבה), במהלך או מיד לאחר התקף התעמלות, לאורך כל התקופה שלאחר האימון במנוחה (בדרך כלל בין 1-3 שעות לאחר הפסקה של תרגיל).
- באמצעות אמצעי זהירות יוניברסל, קודם לחטא את האצבע עם אלכוהול איזופרופילי 70%.
- לנקב הבא, האתר באמצעות אזמל אוטומטיות או מכשיר דומה. למרות שאנו משתמשים 30-Lancet מד לספק לנוחות הנושא, מחט מד גדול יכול להיות מנוצל.
- לנגב את טיפת הדם הראשונה, ולאחר מכן לאסוף דם לתוך צינורות או microvettes נימי שטופלו הפרין ליתיום כדי למנוע קרישה.
2. תא Phenotyping והכתים אפופטוזיס
- הוסף 10 μL דם כל heparinized ללוח נוגדן titred במאגר 250 מחייב μL (ראה טבלה 1 סכמטית). השתמשנו גורם לדילול 1:20 עם הצלחה, אבל כל מעבדה צריכה titre ריאגנטים שלהם כדי לקבוע את הפתרון הטוב ביותר לעבוד.
1. טבלת נוגדן פאנל להגדרה של אפופטוזיס התעמלות-Induced תת ליקוציט. אפופטוזיס מוקדם הוגדרה על ידי ביטוי של Annexin V, בעוד אפופטוזיס מאוחר הוגדרה על ידי תיוג חיובי כפול עם Annexin V ו-7-AAD. תאים נקרוטי היו Annexin V-7 ו-AAD + תאים בלבד.Tube 1 Tube 2 Tube 3 Tube 4 תאים רק צינור Annexin V - FITC Annexin V - FITC Annexin V - FITC CD4 האדם האנטי - PE נגד אדם CD8 - PE נגד אדם CD19 - PE 7-AAD 7-AAD 7-AAD נגד אדם CD45RA - APC נגד אדם CD45RA - APC
7-AAD = 7-אמינו actinomycin-D, APC = Allophycocyanin, CD4 = Helper לימפוציטים מסוג T, CD8 מדכא = / ציטוטוקסיות לימפוציטים מסוג T, CD19 = B לימפוציטים, CD45RA = תת תא נאיבי, FITC = isothiocyanate והעמסת, PE = Phycoerythrin. - דגירה בטמפרטורת החדר בחושך במשך 30 דקות.
- צנטריפוגה XG ב 1075 למשך 5-10 דקות.
- למזוג, להוסיף 300 תא דם אדום μL הצפת תמוגה, וביסודיות מערבולת.
- דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
- הוספת 300 PBS μL להפסיק התגובה RBC תמוגה.
- צנטריפוגה XG ב 1075 למשך 5-10 דקות.
- למזוג, מתלה, ולהוסיף 50 חיץ מחייב μL.
- ניתוח על ידי cytometry הזרימה.
מומלץ כי לכל הפחות, את הפקדים הבאים להיות מנוצל: תאים רק צינור לשמש מלאה שלילי באיתור autofluorescence רקע, וצינורות המכיל בנפרד fluorochrome לקבוע פיצוי במהלך הראשוני של cytometer להגדיר את הזרימה. בנוסף, השתמשנו תקן חרוזים פיצויים בהצלחה להגדיר ניסויים שלנו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אוסף פולשנית מדגם הליך ניתוח שלאחר מכן באה לידי ביטוי לניתוח שלבי בשלבים מוקדמים ומאוחרים של אפופטוזיס האימון המושרה לימפוציטים. ניתן גם בבירור לכלול תאים אלה, המהווים נמקי, ולא אפופטוטיים. הליך זה מתגבר על החסרונות ואי נוחות הקשורה venipuncture פולשנית מאזור antecubital בנקודות זמן רבות לפני, במהלך, מיד לאחר האימון, או הבטחת קטטר למשך התקף התרגיל. מבחינת החוקרים, נהלים כאלה בדרך כלל דורשים הכשרה מיוחדת phlebotomy, שלא כל אדם צריך. בנוסף, נושא גיוס ושימור צפויה להיות משופרת באמצעות הליך זה, ובכך להגביר את כוח סטטיסטי פוטנציאל למצוא השפעה משמעותית אם הוא ההווה.
חקירות קודמות העסקת דם הדגימה venipuncture דיווחו ערכים מנוחה שלאחר האימון של לימפוציטים הכוללת. ניצול annexin V, סימפסון et al. דיווחו כ לימפוציטים אפופטוטיים 1.2% במנוחה ו ~ הליכון הבאה 1.3% פועל 1. כמו כן, דיווחו Steensberg et al. ~ לימפוציטים 1.8% אפופטוטיים במנוחה מוחלטת, וכ 2.1% לאחר 2.5 שעות של ריצה 2. התוצאות שלנו עבור לימפוציטים באמצעות ההליך אפופטוטיים אצבע מקל המתואר כאן דומים, עם 0.7 ± 0.2% שנצפו במנוחה, ו 1.1 ± 0.4% לאחר תרגיל בחמישה נושאים שסיימו בדיקה גופנית מדורגים (תוצאות לא פורסם).
אחת המגבלות של המתודולוגיה שהופעלה כדי לקבוע שנגרם כתוצאה מפעילות גופנית מוות של תאים חיסוניים היה משך הזמן הנדרש לתהליך דגימת דם. בחקירות קודמות, דגימות שהתקבלו postexercise מיד venipuncture היו נתונים בבידוד ממושכת תהליך הכנה (כל עוד 2 ח) לפני בסופו של דבר המוערך על מוות של תאים 3-5. סביר לשער כי עיכובים עיבוד כזה עשוי להעלות באופן מלאכותי דיווחו שלאחר האימון אפופטוזיס ערכי לימפוציטים. במקרים מסוימים, annexin לימפוציטים V חיובי דווחו להיות גבוה ככל 25% ~ 6. פרשנות נוספת confounder זה מתודולוגיים מעלה את השאלה האם בערכים מדווחים על אפופטוזיס הלימפוציטים היו בשל פעילות גופנית או עיבוד עיכובים דם. הצענו המתודולוגיה הקודמת לא משקפות במדויק את ההשפעה כי פעילות גופנית יש על גרימת מותם של תאים תאים חיסוניים 7.
ניצול המתודולוגיה הפגינו כאן מקטין את כמות הדם הנדרשת לכל נקודת זמן איסוף. כמו כן, הגישה שלנו פוחתת מדגם עיבוד זמן, אשר עשוי להפחית את ההיארעות של תוצאות חיוביות שגויות עבור אפופטוזיס לימפוציטים. בפרוטוקול זה, דם כל מתווסף בלוח נוגדנים בתוך 30 שניות לאחר איסוף הדם, ובכך מקטין את הפוטנציאל כי לימפוציטים התקדמות בתהליך אפופטוטיים והם בוטלו לפני מכתים נוגדן. הליך זה מתגבר על מגבלות מדידה דנו בעבר, ומאפשר כימות של לימפוציטים אפופטוטיים הנגרמת על ידי פעילות גופנית כמו גירוי פיזיולוגי. מחקר עתידי לגבי מתודולוגיה זו צריכה להעריך את ההבדלים עם פוטנציאל אזמלי מד גדול יותר.
בנוסף, המתודולוגיה המתוארת במאמר זה מאפשרת קביעת שלב בשלבים מוקדמים ומאוחרים תרגיל המושרה אפופטוזיס תת הלימפוציטים (ראה לוח 1). תאים מוכתם Annexin V רק בשלב מוקדם של אפופטוזיס, ואילו מכתים פעמיים עם Annexin V ו-7-AAD מצביעים התקדמות בתהליך מוות התא בשלבים האחרונים. תאים המסומנים 7-AAD לבד מעידים על מוות של תאים העוברים דרך נמק. Phenotyping של לימפוציטים מושגת באמצעות מקבץ של סמנים בידול (CD4 = עוזר לימפוציטים מסוג T, CD8 = ציטוטוקסיות / מדכא לימפוציטים מסוג T, CD45RA = subfractions נאיבי, CD19 = לימפוציטים-B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי מענק הפקולטה חדש מהמועצה הפקולטה מלגות בבית המערבי אוניברסיטת קנטאקי.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow Cytometry Binding Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | ||
| RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4333-57 | ||
| Lancet Device | Accu Check Soft Touch | Roche Group | ||
| Capillary tubes | Heparinized Capillary Tubes | Chase Scientific Glass, Inc. | 501 | |
| Centrifuge | GmC Lab | Gilson, Inc. | PMS-880 | |
| Annexin V-FITC Conjugated | Biovision Inc. | K201-400-1 | ||
| CD4-PE Conjugated | Anti-human, clone RPA-T4 | eBioscience | 12-0049-42 | |
| CD8-PE Conjugated | Anti-human, clone OKT8 | eBioscience | 12-0086-73 | |
| CD19-PE Conjugated | Anti-human, clone HIB19 | eBioscience | 12-0199-42 | |
| 7-AAD Viability Staining Solution | eBioscience | 00-6993-50 | ||
| CD45RA-APC Conjugated | Anti-human, clone HI100 | eBioscience | 17-0458-42 | |
| Flow cytometer | C6 | Accuri |
References
- Simpson, R. J., Florida-James, G. D., Whyte, G. P., Black, J. R., Ross, J. A., Guy, K. Apoptosis does not contribute to the blood lymphocytopenia observed after intensive and downhill treadmill running in humans. Res. Sports Med. 15, 157-174 (2007).
- Steensberg, A., Morrow, J., Toft, A. D., Bruunsgaard, H., Pedersen, B. K. Prolonged exercise, lymphocyte apoptosis and F2-isoprostanes. Eur. J. Appl. Physiol. 87, 38-42 (2002).
- Mooren, F. C., Bloming, D., Lechtermann, A., Lerch, M. M., Völker, K. Lymphocyte apoptosis after exhaustive and moderate exercise. J. Appl. Physiol. 93, 147-153 (2002).
- Peters, E. M., Eden, M. V. an, Tyler, N., Ramautar, A., Chutergoon, A. A. Prolonged exercise does not cause lymphocyte DNA damage or increased apoptosis in well-trained endurance athletes. Eur. J. Appl. Physiol. 98, 124-131 (2006).
- Wang, J. -S., Huang, Y. -H. Effects of exercise intensity on lymphocyte apoptosis induced by oxidative stress in men. Eur. J. Appl. Physiol. 95, 290-291 (2005).
- Mooren, F. C., Lechtermann, A., Völker, K. Exercise-induced apoptosis of lymphocytes depends on training status. Med. Sci. Sports Exerc. 36, 1476-1483 (2004).
- Navalta, J. W., Sedlock, D. A., Park, K. -S. Blood treatment influences the yield of apoptotic lymphocytes after maximal exercise. Med. Sci. Sports Exerc. 37, 369-373 (2005).
