Summary
व्यायाम प्रतिरक्षा कोशिकाओं में apoptosis उत्प्रेरण के लिए सक्षम है. वहाँ विभिन्न माप सीमाएं हैं, विशेष रूप से समय की राशि को अलग करने और आकलन करने के लिए पहले एक खून का नमूना के इलाज के लिए आवश्यक करने के लिए संबंधित. का प्रदर्शन किया व्यायाम प्रेरित लिम्फोसाइट apoptosis के विश्लेषण के लिए एक तेजी से और न्यूनतम इनवेसिव प्रक्रिया है.
Abstract
व्यायाम एक शारीरिक उत्तेजना प्रतिरक्षा कोशिकाओं में apoptosis उत्प्रेरण के लिए सक्षम है. तिथि करने के लिए, इस घटना के माप के साथ विभिन्न सीमाओं की पहचान की गई है, विशेष रूप से समय की राशि को अलग और कोशिका मृत्यु का मूल्यांकन करने से पहले एक खून का नमूना के इलाज के लिए आवश्यक करने के लिए संबंधित. इस वजह से, यह मुश्किल है निर्धारित करने के लिए है कि क्या प्रतिरक्षा सेल apoptosis में रिपोर्ट बढ़ जाती है प्रणाली पर व्यायाम के वास्तविक प्रभाव के लिए योगदान किया जा सकता है, या समय और अंततः इस माप प्राप्त करने के लिए आवश्यक प्रसंस्करण का एक प्रतिबिंब हैं. इस अनुच्छेद में हम व्यायाम प्रेरित लिम्फोसाइट apoptosis के विश्लेषण के लिए एक तेजी से और न्यूनतम इनवेसिव प्रक्रिया प्रदर्शित करता है. अन्य तकनीकों के विपरीत, पूरे रक्त एक एंटीबॉडी पैनल में जोड़ा जाता है तुरंत एक नमूना प्राप्त करने पर. ऊष्मायन अवधि के बाद, लाल रक्त कोशिकाओं lysed हैं और नमूने विश्लेषण किया जा के लिए तैयार हैं. उंगली छड़ी एक नमूना प्रक्रिया के उपयोग की आवश्यकता रक्त की मात्रा कम कर देता है, और विषयों के लिए बेचैनी कम से कम.
Protocol
1. उंगली छड़ी रक्त नमूनाकरण
- पूरे रक्त का संग्रह एक आधारभूत माप (आमतौर पर 10-15 मिनट बैठे बाकी के बाद) के दौरान, के लिए या तुरंत एक व्यायाम मुक्केबाज़ी के बाद, और व्यायाम के बाद की अवधि के दौरान आम तौर पर आराम में ले लिया की समाप्ति के बाद (आम तौर पर 1-3 घंटे से व्यायाम).
- यूनिवर्सल सावधानियों का प्रयोग, पहली बार 70% isopropyl शराब के साथ उंगलियों बाँझ.
- अगले, एक स्वचालित नुकीला या इसी तरह के डिवाइस का उपयोग कर साइट पंचर. यद्यपि हम एक 30 गेज नुकीला का उपयोग करने के लिए विषय आराम के लिए प्रदान करते हैं, एक बड़े गेज सुई का उपयोग किया जा सकता है.
- रक्त के पहले ड्रॉप दूर पोछो, और तब केशिका ट्यूब या microvettes लिथियम हेपरिन के साथ इलाज के थक्के रोकने में रक्त इकट्ठा.
2. सेल phenotyping और Apoptosis धुंधला
- 250 μL बाध्यकारी बफर में titred एंटीबॉडी पैनल (देखें तालिका 1 योजनाबद्ध) 10 μL heparinized पूरे रक्त जोड़ें. हम सफलता के साथ एक 1:20 कमजोर पड़ने कारक का इस्तेमाल किया है, लेकिन प्रत्येक प्रयोगशाला अभिकर्मकों titre के लिए सबसे अच्छा काम कर समाधान का निर्धारण करना चाहिए.
तालिका 1. ल्युकोसैट सबसेट में व्यायाम प्रेरित apoptosis के निर्धारण के लिए एंटीबॉडी पैनल. जल्दी apoptosis Annexin वी की अभिव्यक्ति के द्वारा परिभाषित किया गया था, जबकि देर से apoptosis Annexin वी और 7-AAD के साथ डबल सकारात्मक लेबलिंग के द्वारा परिभाषित किया गया था. परिगलित कोशिकाओं वी और 7 AAD कोशिकाओं + Annexin ही थे.1 ट्यूब 2 ट्यूब 3 ट्यूब 4 ट्यूब कक्ष केवल ट्यूब Annexin वी - FITC Annexin वी - FITC Annexin वी - FITC विरोधी मानव CD4 - पीई विरोधी मानव CD8 - पीई विरोधी मानव CD19 - पीई 7 - AAD 7 - AAD 7 - AAD विरोधी मानव CD45RA - APC विरोधी मानव CD45RA - APC
7 - AAD =-7 एमिनो actinomycin डी, APC = Allophycocyanin, सीडी 4 = हेल्पर टी lymphocytes, CD8 = शमन / साइटोटोक्सिक टी lymphocytes, CD19 = बी lymphocytes, CD45RA = भोले सेल सबसेट, FITC = fluorescein आइसोथियोसाइनेट, पीई = Phycoerythrin. - 30 मिनट के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर सेते हैं.
- 5-10 मिनट के लिए 1075 XG पर अपकेंद्रित्र.
- छानना, 300 μL लाल रक्त कोशिका lysis बफर जोड़ने के लिए, और अच्छी तरह भंवर.
- 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
- 300 μL पीबीएस जोड़ें आरबीसी lysis प्रतिक्रिया बंद करो.
- 5-10 मिनट के लिए 1075 XG पर अपकेंद्रित्र.
- छानना, रैक, और 50 μL बाध्यकारी बफर जोड़ने.
- प्रवाह cytometry से विश्लेषण.
यह सिफारिश की है कि एक न्यूनतम पर, निम्न नियंत्रण का उपयोग किया जा कोशिकाओं केवल ट्यूब पृष्ठभूमि autofluorescence का पता लगाने में एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए, और प्रत्येक व्यक्ति युक्त ट्यूबों प्रवाह cytometer की स्थापना की प्रारंभिक दौरान मुआवजा सेट fluorochrome. इसके अलावा, हम मुआवजा मानक मोती का इस्तेमाल किया है सफलतापूर्वक हमारे प्रयोगों सेट.
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Discussion
व्यायाम प्रेरित apoptosis लिम्फोसाइट के दोनों जल्दी और देर चरणों के विश्लेषण के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव नमूना संग्रह की प्रक्रिया और बाद में विश्लेषण प्रदर्शन किया है. यह भी संभव है स्पष्ट रूप से उन कोशिकाओं को, जो परिगलित है, और नहीं apoptotic हैं बाहर. इस प्रक्रिया से पहले कई बार बिंदुओं पर antecubital क्षेत्र से आक्रामक venipuncture के साथ जुड़े कमियां और बेचैनी पर काबू पा, के दौरान और व्यायाम के बाद तुरंत, या व्यायाम मुक्केबाज़ी की अवधि के लिए एक कैथेटर हासिल है. जांचकर्ताओं के संदर्भ में, ऐसी प्रक्रियाओं को आम तौर पर फ़स्त खोलना, जो नहीं सभी व्यक्तियों में विशेष प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है. इसके अलावा, विषय भर्ती और प्रतिधारण के लिए इस कार्यविधि का उपयोग बढ़ाया जा उम्मीद है, इस प्रकार एक महत्वपूर्ण प्रभाव ढूँढने के लिए संभावित सांख्यिकीय शक्ति बढ़ रही है अगर एक मौजूद है.
पिछला रोजगार venipuncture रक्त नमूने जांच समग्र लिम्फोसाइटों के लिए आराम और व्यायाम के बाद मूल्यों की सूचना दी है. Annexin वी, सिम्पसन एट अल. उपयोग आराम में लगभग 1.2% apoptotic लिम्फोसाइटों की सूचना दी, और ~ 1.3% निम्नलिखित ट्रेडमिल 1 चल रहा है. इसी तरह, Steensberg एट अल. ~ 1.8% आराम में कुल apoptotic लिम्फोसाइटों, 2.1% लगभग 2 चल रहा है की 2.5 घंटे के बाद सूचना दी. Apoptotic उंगली छड़ी प्रक्रिया यहाँ वर्णित का उपयोग लिम्फोसाइटों के लिए हमारी परिणामों के समान हैं, 0.7 ± 0.2% आराम में मनाया, और 1.1 ± 0.4% के बाद पांच विषयों जो एक वर्गीकृत व्यायाम परीक्षण (अप्रकाशित परिणाम) पूरा में व्यायाम.
पिछले व्यायाम प्रेरित प्रतिरक्षा कोशिका मृत्यु का निर्धारण किया पद्धति की सीमाओं के समय की राशि के लिए एक खून का नमूना प्रक्रिया के लिए आवश्यक था. पिछले जांच, नमूने तुरंत postexercise venipuncture द्वारा प्राप्त किया गया और अंततः सेल 3-5 मौत के लिए मूल्यांकन किया जा रहा से पहले एक लंबा अलगाव और तैयार करने की प्रक्रिया के लिए (के रूप में 2 घंटे के रूप में लंबे समय) के अधीन है. अटकलें हैं कि इस तरह के संसाधन में देरी कृत्रिम रिपोर्ट के बाद व्यायाम लिम्फोसाइट apoptosis मूल्यों तरक्की हो सकता है यह उचित है. कुछ मामलों में, annexin वी सकारात्मक लिम्फोसाइटों के रूप में ~ 25 6% के रूप में उच्च के रूप में सूचित किया गया है. इस पद्धति confounder के आगे व्याख्या का सवाल है कि apoptosis के लिए सूचित लिम्फोसाइट मूल्यों व्यायाम या रक्त प्रसंस्करण देरी के कारण थे उठाती है. हमने सुझाव दिया है कि पिछले पद्धति सही है कि व्यायाम प्रतिरक्षा कोशिकाओं में कोशिका मृत्यु 7 उत्प्रेरण पर प्रभाव को प्रतिबिंबित नहीं किया.
यहाँ प्रदर्शन पद्धति का उपयोग प्रत्येक संग्रह समय बिंदु के लिए आवश्यक रक्त की मात्रा घट जाती है. इसके अलावा, हमारे दृष्टिकोण नमूना प्रसंस्करण समय कम हो जाती है, जो लिम्फोसाइट apoptosis के लिए झूठी सकारात्मक की घटनाओं को कम कर सकते हैं. इस प्रोटोकॉल में, 30 सेकंड के भीतर पूरे रक्त एंटीबॉडी पैनल जोड़ा रक्त संग्रह के बाद, इस प्रकार संभावित है कि apoptotic प्रक्रिया के माध्यम से प्रगति और लिम्फोसाइटों एंटीबॉडी धुंधला करने से पहले समाप्त हो जाते हैं कम. यह प्रक्रिया पहले से चर्चा की माप सीमाओं पर काबू, और apoptotic एक शारीरिक प्रोत्साहन के रूप में व्यायाम से प्रेरित लिम्फोसाइटों की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है. इस पद्धति के संबंध के साथ भविष्य के अध्ययन बड़ा गेज lancets के साथ संभावित अंतर का मूल्यांकन करना चाहिए.
इसके अलावा, इस पत्र में वर्णित पद्धति दोनों जल्दी और देर व्यायाम प्रेरित लिम्फोसाइट सबसेट में apoptosis (देखें तालिका 1) मंच के निर्धारण के लिए अनुमति देता है. Annexin वी के साथ दाग कक्ष apoptosis के प्रारंभिक चरण में ही हैं, जबकि डबल Annexin वी और 7-AAD के साथ धुंधला कोशिका मृत्यु की प्रक्रिया के माध्यम से प्रगति के बाद के चरणों के लिए संकेत मिलता है. अकेले सात AAD के साथ चिह्नित कक्ष परिगलन के माध्यम से कोशिका मृत्यु के दौर से गुजर की संकेत हैं. लिम्फोसाइटों के phenotyping भेदभाव मार्करों के क्लस्टर के माध्यम से पूरा किया है (सीडी 4 = सहायक टी lymphocytes, CD8 = साइटोटोक्सिक / शमन टी - लिम्फोसाइटों, CD45RA = भोली subfractions, CD19 = बी लिम्फोसाइटों).
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस शोध पश्चिमी केंटकी विश्वविद्यालय में संकाय छात्रवृत्ति परिषद से एक नई संकाय अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow Cytometry Binding Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | ||
| RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4333-57 | ||
| Lancet Device | Accu Check Soft Touch | Roche Group | ||
| Capillary tubes | Heparinized Capillary Tubes | Chase Scientific Glass, Inc. | 501 | |
| Centrifuge | GmC Lab | Gilson, Inc. | PMS-880 | |
| Annexin V-FITC Conjugated | Biovision Inc. | K201-400-1 | ||
| CD4-PE Conjugated | Anti-human, clone RPA-T4 | eBioscience | 12-0049-42 | |
| CD8-PE Conjugated | Anti-human, clone OKT8 | eBioscience | 12-0086-73 | |
| CD19-PE Conjugated | Anti-human, clone HIB19 | eBioscience | 12-0199-42 | |
| 7-AAD Viability Staining Solution | eBioscience | 00-6993-50 | ||
| CD45RA-APC Conjugated | Anti-human, clone HI100 | eBioscience | 17-0458-42 | |
| Flow cytometer | C6 | Accuri |
References
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