Summary
운동은 면역 세포의 apoptosis를 유도 할 수있다. 다양한 측정 한계는 특히 사전 심사에 혈액 샘플을 분리하고 치료하는 데 필요한 시간의 양을 관련된있다. 보여주는 운동 유발성 림프구의 apoptosis의 분석을위한 신속하고 법으로서 절차입니다.
Abstract
운동은 면역 세포의 apoptosis를 유도하는 수있는 생리적 자극이다. 지금까지 다양한 제한은 특히 이전에 세포 죽음의 평가에 혈액 샘플을 분리하고 치료하는 데 필요한 시간의 양을에 관한,이 현상의 측정과 확인되었습니다. 이 때문에 면역 세포 apoptosis에보고 증가가 시스템에 대한 운동의 실질적인 효과에 기여하거나, 결국이 측정을 얻기 위해 필요한 시간과 처리를 반영 아르 될 수 있는지 여부를 확인하기가 어렵습니다. 이 문서에서 우리는 운동 유발성 apoptosis 림프구의 분석을위한 신속하고 법으로서 절차를 보여줍니다. 다른 기법과는 달리, 전체 혈액 샘플을 취득 즉시 항체 패널에 추가됩니다. 잠복기에 따라, 적혈구는 lysed 및 샘플 분석 준비입니다. 손가락 - 스틱 샘플링 절차의 사용은 필요한 혈액의 볼륨을 감소하고, 주제에 대한 불편을 최소화합니다.
Protocol
1. 손가락 - 스틱 혈액 샘플링
- 전체 혈액의 컬렉션은 일반적으로의 정지 다음 (일반적으로 1~3시간에서 동안 기준 측정 (보통 10-15 분 앉아 휴식을 다음) 또는 즉시 운동 시합에 따라, 그리고 사후 운동 기간 동안 휴식을 취해 운동).
- 유니버설주의를 사용하면, 먼저 70% 이소 프로필 알코올로 손가락을 소독.
- 다음 찔린 자동 첨두 또는 유사한 장치를 사용하여 사이트입니다. 우리가 주제 편안함을 제공하는 30 게이지 랜싯를 사용하지만, 더 큰 게이지 주사 바늘을 이용 할 수 있습니다.
- 혈액의 첫 번째 드롭을 닦아 후 응고 방지하기 위해 리튬 헤파린 취급 모세관 튜브 또는 microvettes에 혈액을 수집합니다.
2. 세포 Phenotyping 및 Apoptosis의 스테 이닝
- 250 μL 바인딩 버퍼에 titred 항체 패널 (표 1 배선도 참조) 10 μL heparinized 전체 혈액을 추가합니다. 우리는 성공을 1시 20분 희석 계수를 사용해야하지만, 각각의 실험실이 최고의 작업 솔루션을 결정하기 위해 시약을 titre해야합니다.
백혈구 집합에서 운동 유발성 apoptosis의 결정에 대해 표 1. 항체 패널. 늦은 apoptosis가 Annexin V 7 - AAD 더블 긍정적인 상표에 의해 정의된 동안 조기 apoptosis는 Annexin V의 표현에 의해 정의되었다. 괴사 세포가 V - 7 - AAD + 세포에만 Annexin했다.튜브 1 튜브 2 관 세 튜브 사 세포는 관 Annexin V - FITC Annexin V - FITC Annexin V - FITC 안티 인간 CD4 - PE 안티 인간 CD8 - PE 안티 인간 CD19 - PE 7 - AAD 7 - AAD 7 - AAD 안티 인간 CD45RA - APC 안티 인간 CD45RA - APC
7 - AAD = 7 - 아미노 actinomycin D, APC = Allophycocyanin, CD4 = 도우미 T의 lymphocytes, CD8 = 세포 독성 / 억제 T의 lymphocytes, CD19 = B lymphocytes, CD45RA = 순진한 세포 하위 집합, FITC = 플루오레신 isothiocyanate, PE = Phycoerythrin. - 30 분 어두운 실온에서 알을 품다.
- 50~10분 위해 1075 XG에 원심 분리기.
- 가만히 따르다가 300 μL 적혈구 세포 용해 완충액을 추가하고, 철저히 소용돌이.
- 15 분 동안 상온에서 알을 품다.
- RBC의 용해 반응을 중지 300 μL PBS를 추가합니다.
- 50~10분 위해 1075 XG에 원심 분리기.
- 가만히 따르다, 랙, 50 μL 구속력 버퍼를 추가합니다.
- 유동세포계측법으로 분석합니다.
전용 튜브 배경 autofluorescence를 감지에 부정적인 제어 역할을하는 세포를, 그리고 각 개별가 포함된 튜브의 흐름 cytometer의 설정 초기 때 보상을 설정 fluorochrome : 이것은 최소한 다음과 같은 컨트롤을 활용하는 것이 좋습니다. 또한, 우리는 실험을 설정 성공적으로 보상 기준 비즈를 사용합니다.
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Discussion
법으로서 샘플 수집 과정 및 후속 분석 운동 유발성 apoptosis 림프구의 조기 늦게 두 단계의 분석에 대한 증명입니다. 그것은 명확하게 괴사 및 apoptotic되지 않은 그 세포를 제외하는 것도 가능합니다. 이 절차 동안, 이전에 여러 시간 지점에서 antecubital 지역에서 침략 venipuncture와 관련된 단점과 불편을 극복하고, 즉시 운동 후 또는 운동 시합 기간 동안 카테터를 확보. 조사의 측면에서, 이러한 절차는 일반적으로 모든 개인이 가지고 정맥 절개, 전문 교육을 필요로합니다. 하나가 존재하는 경우뿐만 아니라, 주제 모집 및 유지이 절차를 사용하여 향상된 것으로 예상된다는, 따라서 큰 영향을 찾을 가능성 통계 능력을 증가.
venipuncture 혈액 샘플링을 채용 이전 조사는 전체 lymphocytes을위한 휴식 및 사후 운동 가치를보고있다. annexin V, 심슨 외 있습니다. 활용하면 휴식을 약 1.2 % apoptotic lymphocytes을보고하고, ~ 1.3 % 아래의 러닝 머신 1을 실행. 마찬가지로, Steensberg 외가. 2를 실행하는 2.5 시간 후 ~ 1.8 % 총 apoptotic 휴식 lymphocytes, 약 2.1 %를보고했다. 손가락 - 스틱 프로 시저 여기에 설명된 내용을 사용하여 apoptotic lymphocytes에 대한 우리의 결과는 0.7과 비슷합니다 ± 0.2 휴식을 관찰 %, 및 1.1 ± 0.4 % 등급 운동 시험 (게시되지 않은 결과를) 완료 다섯 과목 이후의 운동.
운동 유발성 면역 세포 죽음을 결정하는 데 사용 이전 방법론의 한계 중 하나는 혈액 샘플을 처리하는 데 필요한 시간의 양을했다. 이전 조사에서는 샘플 결국 세포 사망 3-5에 대한 평가되기 전에 (2 H만큼) 긴 고립과 준비 절차의 대상이되었다 venipuncture하여 즉시 postexercise을 획득하였습니다. 이 같은 처리 지연이 인위적으로 보고된 이후 운동 림프구의 apoptosis 가치를 제고 수 추측하기 위해 합당한 것입니다. 어떤 경우에는, annexin V 긍정적인 lymphocytes은 ~ 25 % 6만큼 높은 것으로보고되었습니다. 이 방법론 confounder의 자세한 해석은 림프구 apoptosis에 대한보고 값이 운동이나 혈액 처리 지연으로 인해되었습니다 여부의 질문을시킵니다. 우리는 이전의 방법은 정확하게 운동은 면역 세포에 7 세포 죽음을 유도에서 가지고 효과를 반영하지 않았 제안했다.
여기서 보여주는 방법론을 활용하면 각 수집 시점에 필요한 혈액의 양을 감소시킵니다. 또한, 우리의 접근 방법은 림프구 apoptosis에 대한 잘못된 반응의 발생을 줄일 수있는, 샘플 처리 시간을 감소시킵니다. 이 프로토콜에서는 전체 혈액 따라서 lymphocytes apoptotic 프로세스를 통해 진행하며 사전에 항체 얼룩을 제거하는 가능성을 감소, 혈액 수집 후 30 초 이내에 항체 패널에 추가됩니다. 이 절차는 이전에 설명한 측정 한계를 극복하고, 생리적 자극으로 운동에 의해 유도된 apoptotic lymphocytes의 부량 수 있도록합니다. 이 방법론과 관련하여 향후 연구에 큰 게이지 lancets있는 잠재적인 차이를 평가한다.
또한, 본 논문에서 설명하는 방법은 림프구 집합에서 운동 유발성 apoptosis (표 1 참조) 초기 늦게 두 단계의 결정을 허용합니다. Annexin V 7 - AAD 더블 - 얼룩은 후반 단계에 세포 죽음의 과정을 통해 진행을 나타내는 반면 Annexin V 물들일 세포는, apoptosis의 초기 단계에 있습니다. 혼자 7 - AAD로 표시된 세포가 괴사를 통해 세포 죽음을 겪고 나타내는 있습니다. lymphocytes의 Phenotyping가 분화 마커의 클러스터를 통해 수행됩니다 (CD4가 = 헬퍼 T - lymphocytes, CD8 T - lymphocytes = 억제 / 세포 독성, CD45RA = 순진한 subfractions, CD19 = B - lymphocytes).
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 웨스턴 켄터키 대학에서 학부 장학금위원회에서 새로운 교수 부여에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow Cytometry Binding Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | ||
| RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4333-57 | ||
| Lancet Device | Accu Check Soft Touch | Roche Group | ||
| Capillary tubes | Heparinized Capillary Tubes | Chase Scientific Glass, Inc. | 501 | |
| Centrifuge | GmC Lab | Gilson, Inc. | PMS-880 | |
| Annexin V-FITC Conjugated | Biovision Inc. | K201-400-1 | ||
| CD4-PE Conjugated | Anti-human, clone RPA-T4 | eBioscience | 12-0049-42 | |
| CD8-PE Conjugated | Anti-human, clone OKT8 | eBioscience | 12-0086-73 | |
| CD19-PE Conjugated | Anti-human, clone HIB19 | eBioscience | 12-0199-42 | |
| 7-AAD Viability Staining Solution | eBioscience | 00-6993-50 | ||
| CD45RA-APC Conjugated | Anti-human, clone HI100 | eBioscience | 17-0458-42 | |
| Flow cytometer | C6 | Accuri |
References
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