Summary
Übung ist in der Lage die Apoptose in Immunzellen. Es gibt verschiedene Mess-Beschränkungen, insbesondere in Bezug auf die benötigte Zeit zu isolieren und zu behandeln, eine Blutprobe vor der Bewertung. Nachgewiesene ist eine schnelle und minimal-invasives Verfahren für die Analyse von belastungsinduzierten Lymphozyten Apoptose.
Abstract
Übung ist ein physiologischer Reiz der Lage, die Apoptose in Immunzellen. Bis heute haben verschiedene Einschränkungen bei der Messung dieses Phänomens identifiziert worden, insbesondere in Bezug auf die benötigte Zeit zu isolieren und zu behandeln, eine Blutprobe vor der Bewertung des Zelltods. Aus diesem Grund ist es schwierig zu entscheiden, ob gemeldete Anstieg der Immun-Zell-Apoptose, um die tatsächlichen Auswirkungen von Bewegung auf das System kann dazu beigetragen werden, oder sind ein Spiegelbild der Zeit und Verarbeitung notwendig, schließlich erhalten diese Messung. In diesem Artikel zeigen wir eine schnelle und minimal-invasives Verfahren zur Analyse der durch körperliche Belastung ausgelöste Lymphozyten Apoptose. Im Gegensatz zu anderen Techniken wird Vollblut mit einem Antikörper-Panel sofort nach Erhalt einer Probe zugegeben. Nach der Inkubationszeit werden die roten Blutzellen lysiert und die Proben sind bereit, analysiert werden. Die Verwendung eines Finger-Stick Stichprobenverfahren reduziert das Volumen des Blutes benötigt, und minimiert das Unbehagen an Themen.
Protocol
1. Finger-Stick Blutprobenentnahme
- Sammlung von Vollblut ist in der Regel in Ruhe für eine Baseline-Messung (in der Regel folgende 10-15 min sitzen Rest), während oder unmittelbar nach einer Trainingseinheit, und während der post-Ausübungsfrist genommen (in der Regel 1-3 Stunden nach Beendigung der Übung).
- Mit Universal-Vorsichtsmaßnahmen, zuerst zu sterilisieren der Fingerspitze mit 70% igem Alkohol.
- Als nächstes Punktion der Website mit Hilfe eines automatisierten Lanzette oder einem ähnlichen Gerät. Obwohl wir eine 30-Gauge-Lanzette nach Thema Komfort nutzen, könnte eine größere Nadel verwendet werden.
- Wischen Sie den ersten Tropfen Blut, und dann sammeln Blut in Kapillaren oder microvettes mit Lithium-Heparin behandelt Gerinnen zu verhindern.
2. Zell-Phänotypisierung und Apoptose-Färbung
- Fügen Sie 10 ul heparinisiertem Vollblut titriert Antikörper-Panel in 250 ul Bindungspuffer (siehe Tabelle 1 schematisch). Wir haben eine 1:20 Verdünnung Faktor mit Erfolg eingesetzt, aber jedes Labor sollte ihren Reagenzien titre die besten funktionierende Lösung zu bestimmen.
Tabelle 1. Antikörper-Panel zur Bestimmung der Ausübung-induzierten Apoptose in Leukozyten Teilmengen. Frühe Apoptose wurde durch die Expression von Annexin V definiert, während späte Apoptose durch doppelte positive Markierung mit Annexin V und 7-AAD definiert wurde. Nekrotischen Zellen wurden Annexin V-und 7-AAD + Zellen nur.Tube 1 Tube 2 Rohr 3 Tube 4 Zellen nur Rohr Annexin V - FITC Annexin V - FITC Annexin V - FITC Anti menschlichen CD4 - PE Anti menschliche CD8 - PE Anti menschliche CD19 - PE 7-AAD 7-AAD 7-AAD Anti Menschliche CD45RA - APC Anti Menschliche CD45RA - APC
7-AAD = 7-Amino-Actinomycin D, APC = Allophycocyanin, CD4 = Helper T-Lymphozyten, CD8 = Suppressor / zytotoxischen T-Lymphozyten, CD19 = B-Lymphozyten, CD45RA = naiv Zellpopulationen, FITC = Fluoresceinisothiocyanat, PE = Phycoerythrin. - Bei Raumtemperatur im Dunkeln für 30 Minuten.
- Zentrifuge bei 1075 xg für 5-10 Minuten.
- Dekantieren, zusätzlich 300 ul Red Blood Cell Lysis Buffer, und gründlich vortexen.
- Inkubieren bei Raumtemperatur für 15 Minuten.
- Geben Sie 300 ul PBS zu RBC Lyse Reaktion zu stoppen.
- Zentrifuge bei 1075 xg für 5-10 Minuten.
- Dekantieren, Rack, und 50 ul Bindungspuffer.
- Analysieren mittels Durchflusszytometrie.
Es wird empfohlen, auf ein Minimum, die folgenden Steuerelemente verwendet werden: a-Zellen nur Röhre als negative Kontrolle bei der Erkennung Hintergrund Autofluoreszenz dienen, und Röhrchen mit jedem einzelnen Fluorochrom auf Entschädigung während der ersten bis der Durchflusszytometer gesetzt. Darüber hinaus haben wir Schadensersatz Standard Perlen erfolgreich zum Aufbau unserer Experimente verwendet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ein minimal-invasive Probennahme und der nachfolgenden Analyse wird für die Analyse der frühen und späten Phasen der Übung-induzierte Lymphozyten Apoptose nachgewiesen. Es ist auch möglich, eindeutig ausschließt diejenigen Zellen, die nekrotisch, und nicht apoptotischer sind. Dieses Verfahren überwindet die Nachteile und Unannehmlichkeiten mit invasive Blutentnahme aus der Ellenbeuge Region zu mehreren Zeitpunkten vor assoziiert, während und unmittelbar nach dem Training oder der Sicherung eines Katheters für die Dauer der Trainingseinheit. In Bezug auf die Ermittler, solche Verfahren erfordern in der Regel spezialisierte Ausbildung in Aderlass, der nicht alle Menschen haben. Darüber hinaus unterliegen Rekrutierung und Bindung wird erwartet, dass verstärkt mit diesem Verfahren werden, wodurch sich die potenzielle statistische Aussagekraft der Suche nach einem signifikanten Effekt, wenn eine vorhanden ist.
Bisherige Untersuchungen beschäftigen Venenpunktion Blutentnahme wurden Ruhe-und post-exercise-Werte für Gesamt-Lymphozyten berichtet. Mit Hilfe Annexin V, Simpson et al. Berichteten etwa 1,2% apoptotischer Lymphozyten in Ruhe, und ~ 1,3% nach Laufband 1. Ebenso berichtet Steensberg et al. ~ 1,8% insgesamt apoptotische Lymphozyten in Ruhe, und ca. 2,1% nach 2,5 Stunden Laufzeit 2. Unsere Ergebnisse für apoptotische Lymphozyten mit dem Finger-Stick hier beschriebene Verfahren sind ähnlich, mit 0,7 ± 0,2% in Ruhe zu beobachten, und 1,1 ± 0,4% nach dem Training in fünf Fächern, die ein abgestuftes Belastungstest (unveröffentlichte Ergebnisse) abgeschlossen.
Eine der Einschränkungen der bisherigen Methodik zur Ausübung-induzierten Immunantwort Zelltod zu bestimmen, wurde die Menge an Zeit benötigt, um eine Blutprobe Prozess. In vorangegangenen Untersuchungen gewonnenen Proben sofort Nachtrainingszeit durch Venenpunktion wurden zu einer langen Trennung und Aufbereitung unterzogen (so lange wie 2 h), bevor schließlich die für den Zelltod 3-5 bewertet. Es ist vernünftig, darüber zu spekulieren, dass solche Verzögerungen in der Bearbeitung kann künstlich erhöhen berichtete nach dem Training Lymphozyten Apoptose Werte. In einigen Fällen wurden Annexin V-positiven Lymphozyten berichtet worden, um so hoch wie ~ 25% 6. Weitere Interpretation dieser methodischen confounder wirft die Frage auf, ob die angegebenen Werte für Lymphozyten Apoptose wurden durch Ausübung oder Blut Verzögerungen in der Bearbeitung. Wir schlugen vor, dass die bisherigen Methoden nicht genau den Effekt, dass Übung hat auf den Zelltod in immune Zellen 7.
Mit Hilfe der Methodik demonstriert hier sinkt die Menge des Blutes für jede Sammlung Zeitpunkt erforderlich. Auch verringert sich unser Ansatz Probe-Bearbeitungszeit, die das Auftreten von Fehlalarmen bei Lymphozyten Apoptose zu reduzieren. In diesem Protokoll wird das Vollblut an den Antikörper-Panel im 30-Sekunden nach der Blutentnahme hinzugefügt, wodurch die Gefahr, dass Lymphozyten Fortschritte durch die apoptotischen Prozess und vor dem Antikörper-Färbung werden eliminiert. Dieses Verfahren überwindet die Messgrenzen zuvor diskutiert, und ermöglicht die Quantifizierung apoptotischer Lymphozyten durch Übung als physiologischer Reiz induziert. Zukünftige Studien mit Bezug auf diese Methodik sollte die potentielle Differenzen mit dickeren Lanzetten.
Darüber hinaus ermöglicht die Methode in diesem Papier beschrieben zur Bestimmung der beiden Früh-und Spätstadium Ausübung-induzierten Apoptose in Lymphozytenuntergruppen (siehe Tabelle 1). Zellen mit Annexin V gefärbt sind nur in der frühen Phase der Apoptose, während Doppel-Färbung mit Annexin V und 7-AAD Progression zeigen, durch den Zelltod zu den letzten Stadien. Zellen mit 7-AAD allein markiert sind bezeichnend für unterziehen Zelltod durch Nekrose. Phänotypisierung der Lymphozyten wird durch Cluster von Differenzierungsmarker erreicht (CD4 = T-Helfer-Lymphozyten, CD8 = zytotoxischen / Suppressor-T-Lymphozyten, CD45RA = naive Subfraktionen, CD19 = B-Lymphozyten).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von einem New Faculty Grant von der Fakultät Scholarship Council an der Western Kentucky University unterstützt.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow Cytometry Binding Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | ||
| RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4333-57 | ||
| Lancet Device | Accu Check Soft Touch | Roche Group | ||
| Capillary tubes | Heparinized Capillary Tubes | Chase Scientific Glass, Inc. | 501 | |
| Centrifuge | GmC Lab | Gilson, Inc. | PMS-880 | |
| Annexin V-FITC Conjugated | Biovision Inc. | K201-400-1 | ||
| CD4-PE Conjugated | Anti-human, clone RPA-T4 | eBioscience | 12-0049-42 | |
| CD8-PE Conjugated | Anti-human, clone OKT8 | eBioscience | 12-0086-73 | |
| CD19-PE Conjugated | Anti-human, clone HIB19 | eBioscience | 12-0199-42 | |
| 7-AAD Viability Staining Solution | eBioscience | 00-6993-50 | ||
| CD45RA-APC Conjugated | Anti-human, clone HI100 | eBioscience | 17-0458-42 | |
| Flow cytometer | C6 | Accuri |
References
- Simpson, R. J., Florida-James, G. D., Whyte, G. P., Black, J. R., Ross, J. A., Guy, K. Apoptosis does not contribute to the blood lymphocytopenia observed after intensive and downhill treadmill running in humans. Res. Sports Med. 15, 157-174 (2007).
- Steensberg, A., Morrow, J., Toft, A. D., Bruunsgaard, H., Pedersen, B. K. Prolonged exercise, lymphocyte apoptosis and F2-isoprostanes. Eur. J. Appl. Physiol. 87, 38-42 (2002).
- Mooren, F. C., Bloming, D., Lechtermann, A., Lerch, M. M., Völker, K. Lymphocyte apoptosis after exhaustive and moderate exercise. J. Appl. Physiol. 93, 147-153 (2002).
- Peters, E. M., Eden, M. V. an, Tyler, N., Ramautar, A., Chutergoon, A. A. Prolonged exercise does not cause lymphocyte DNA damage or increased apoptosis in well-trained endurance athletes. Eur. J. Appl. Physiol. 98, 124-131 (2006).
- Wang, J. -S., Huang, Y. -H. Effects of exercise intensity on lymphocyte apoptosis induced by oxidative stress in men. Eur. J. Appl. Physiol. 95, 290-291 (2005).
- Mooren, F. C., Lechtermann, A., Völker, K. Exercise-induced apoptosis of lymphocytes depends on training status. Med. Sci. Sports Exerc. 36, 1476-1483 (2004).
- Navalta, J. W., Sedlock, D. A., Park, K. -S. Blood treatment influences the yield of apoptotic lymphocytes after maximal exercise. Med. Sci. Sports Exerc. 37, 369-373 (2005).
