Summary
Физические упражнения способны индуцировать апоптоз клеток иммунной системы. Существуют различные ограничения измерения, особенно в отношении количества времени, необходимого для изоляции и лечения крови до проведения оценки. Продемонстрированный является быстрым и минимально инвазивные процедуры для анализа упражнения-индуцированного апоптоза лимфоцитов.
Abstract
Упражнение физиологические стимулы способны вызывать апоптоз клеток иммунной системы. На сегодняшний день различные ограничения были выявлены с измерением этого явления, особенно в отношении количества времени, необходимого для изоляции и лечения крови до оценку гибели клеток. Из-за этого, трудно определить, является ли сообщили об увеличении апоптоза клеток иммунной могут быть внесены в реальный эффект физических упражнений на системы, или являются отражением времени и обработки необходимо получить в конечном итоге это измерение. В этой статье мы демонстрируем быстрое и минимально инвазивные процедуры для анализа вызванная осуществлением лимфоцитов апоптоза. В отличие от других методов, цельной крови добавляют антитела панели сразу же после получения образца. После инкубационного периода, красные кровяные клетки лизируются и образцы готовы для анализа. Использование пальца придерживаться процедуры отбора образцов, уменьшает объем крови необходимо, и свести к минимуму неудобства для предметов.
Protocol
1. Finger-Stick забора крови
- Коллекция цельной крови, как правило, принято на отдых для базовых измерений (обычно после 10-15 мин сидя покоя), во время или сразу после упражнений боя, и во всем после упражнений период (как правило, от 1-3 часов после прекращения упражнения).
- Использование универсальных мер предосторожности, первый стерилизовать пальца с 70% изопропилового спирта.
- Далее прокол сайт с помощью автоматизированной ланцет или аналогичного устройства. Хотя мы используем 30-калибр ланцет для обеспечения теме комфорта, большие иглы могут быть использованы.
- Сотрите первую каплю крови, а затем собирать крови в капиллярах или microvettes получавших литий гепарина для предотвращения свертывания крови.
2. Фенотипирование клеток и апоптоз Окрашивание
- Добавьте 10 мкл гепаринизированной цельной крови titred панели антител в 250 мкл буфера для связывания (см. таблицу 1 схема). Мы использовали фактор 1:20 разбавления успех, но каждая лаборатория должна титр их реагентов для определения наилучшего рабочего раствора.
Таблица 1. Антитела панель для определения упражнения-индуцированного апоптоза лейкоцитов подмножеств. Ранний апоптоз была определена выражением Аннексин V, в то время как поздний апоптоз был определен двойной положительный маркировки с Аннексин V и 7-AAD. Некротические клетки Аннексин V-и 7-AAD + клеток только.Труба 1 Tube 2 Труба 3 Труба 4 Клетки только трубки Аннексин V - FITC Аннексин V - FITC Аннексин V - FITC Антивирус правам CD4 - PE Антивирус правам CD8 - PE Антивирус правам CD19 - PE 7-AAD 7-AAD 7-AAD Антивирус правам CD45RA - APC Антивирус правам CD45RA - APC
7-AAD = 7-амино-актиномицин D, APC = Allophycocyanin, CD4 = Помощник Т-лимфоцитов, CD8 = подавитель / цитотоксических Т-лимфоцитов, CD19 = В-лимфоцитов, CD45RA = подмножества наивные клетки, FITC = Fluorescein изотиоцианата, PE = фикоэритрин. - Инкубируйте при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут.
- Центрифуга на 1075 мкг в течение 5-10 минут.
- Декантировать, добавьте 300 мкл эритроцитов Лизис буфера и тщательно вихря.
- Инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 минут.
- Добавить 300 мкл PBS, чтобы остановить лизиса реакции.
- Центрифуга на 1075 мкг в течение 5-10 минут.
- Декантировать, стойки, и добавить 50 мкл буфера для связывания.
- Анализ с помощью проточной цитометрии.
Рекомендуется, как минимум, следующие элементы управления быть использованы: клетки только трубки в качестве отрицательного контроля в выявлении фоне аутофлюоресценция и пробирки, содержащие каждый флуорохромом установить компенсацию во время начальной настройки потока цитометр. Кроме того, мы использовали бисер компенсации стандартных успешно, чтобы сопоставить наши эксперименты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Малоинвазивных Пример процедуры сбора и последующего анализа показано, для анализа как ранние и поздние фазы вызванная осуществлением лимфоцитов апоптоза. Кроме того, можно четко исключить те клетки, которые являются некротические, а не апоптоза. Эта процедура позволяет преодолеть недостатки и дискомфорт, связанный с инвазивной вены из локтевой области в нескольких точках времени до, во время и сразу после тренировки, или крепления катетера в течение всего срока осуществления боя. С точки зрения исследователей, такие процедуры как правило, требуют специальной подготовки в кровопускание, которое не все люди имеют. Кроме того, вербовки и удержания предмета как ожидается, будет улучшено с использованием этой процедуры, тем самым увеличивая потенциал статистической мощности нахождения значительного эффекта, если таковой имеется.
Предыдущие исследования применения выборки вены кровь сообщили отдыха и после упражнений значения для общих лимфоцитов. Используя аннексина V, Симпсон и соавт. Сообщили приблизительно на 1,2% апоптоза лимфоцитов в покое, и ~ 1,3% после беговой дорожке 1. Точно так же Steensberg и соавт. Сообщили ~ 1,8% от общего апоптоза лимфоцитов в покое, и примерно 2,1% после 2,5 часов работы 2. Наши результаты для апоптоза лимфоцитов использованием пальца придерживаться процедуры, описанные здесь, похоже, с 0,7 ± 0,2% наблюдается в покое и 1,1 ± 0,4% после упражнений по пяти предметам, которые прошли испытание градуированных упражнений (неопубликованные результаты).
Одним из недостатков предыдущих методология используется для определения вызванная осуществлением иммунной клеточной смерти было количество времени, необходимое для обработки крови. В предыдущих исследованиях, образцы, полученные непосредственно postexercise из вены были подвергнуты длительной изоляции и процесс подготовки (в течение 2 ч), прежде чем в конечном итоге оценивается на гибель клеток 3-5. Резонно предположить, что такие задержки обработки может искусственно поднять сообщил после тренировки значения лимфоцитов апоптоза. В некоторых случаях, аннексина V-положительные лимфоциты, как сообщается, достигает ~ 25% 6. Дальнейшая интерпретация этого методологического confounder поднимает вопрос о том, сообщило значения для апоптоза лимфоцитов должны были осуществлять или задержки крови обработки. Мы предположили, что предыдущая методология не совсем точно отражает том, что упражнения на вызывающих гибель клеток в клетки иммунной системы 7.
Используя методологию продемонстрировали здесь уменьшается количество крови, необходимое для каждой точки времени сбора. Кроме того, наш подход уменьшает образец время обработки, которые могут снизить частоту ложных срабатываний для лимфоцитов апоптоза. В этом протоколе цельной крови добавляют антитела панели в пределах 30-секунд после взятия крови, тем самым уменьшая вероятность того, что лимфоциты прогресс через процесс апоптоза и выбывший до антитела окрашивания. Эта процедура позволяет преодолеть ограничения измерения обсуждалось ранее, и позволяет осуществлять количественную оценку апоптоза лимфоцитов индуцированных упражнения как физиологический стимул. Будущие исследования в отношении этой методологии должны оценить потенциальные разногласия с большим ланцеты колеи.
Кроме того, методики, описанной в этой статье предусматривает определение раннего и позднего этапа упражнения-индуцированного апоптоза в лимфоцитах (см. Таблицу 1). Клетки окрашивали Аннексин V только в ранней стадии апоптоза, в то время как двойной окраске Аннексин V и 7-AAD указывают прохождения через процесс гибели клеток на поздних стадиях. Клетки, отмеченные 7-AAD сами по себе свидетельствует о переживает гибель клеток путем некроза. Фенотипирование лимфоцитов осуществляется через кластер дифференциации маркеров (CD4 = помощник Т-лимфоцитов, CD8 = цитотоксических / супрессорных Т-лимфоцитов, CD45RA = наивные подфракций, CD19 = B-лимфоциты).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Новый грант факультета с Советом факультета стипендию в Университете Западного Кентукки.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow Cytometry Binding Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | ||
| RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4333-57 | ||
| Lancet Device | Accu Check Soft Touch | Roche Group | ||
| Capillary tubes | Heparinized Capillary Tubes | Chase Scientific Glass, Inc. | 501 | |
| Centrifuge | GmC Lab | Gilson, Inc. | PMS-880 | |
| Annexin V-FITC Conjugated | Biovision Inc. | K201-400-1 | ||
| CD4-PE Conjugated | Anti-human, clone RPA-T4 | eBioscience | 12-0049-42 | |
| CD8-PE Conjugated | Anti-human, clone OKT8 | eBioscience | 12-0086-73 | |
| CD19-PE Conjugated | Anti-human, clone HIB19 | eBioscience | 12-0199-42 | |
| 7-AAD Viability Staining Solution | eBioscience | 00-6993-50 | ||
| CD45RA-APC Conjugated | Anti-human, clone HI100 | eBioscience | 17-0458-42 | |
| Flow cytometer | C6 | Accuri |
References
- Simpson, R. J., Florida-James, G. D., Whyte, G. P., Black, J. R., Ross, J. A., Guy, K. Apoptosis does not contribute to the blood lymphocytopenia observed after intensive and downhill treadmill running in humans. Res. Sports Med. 15, 157-174 (2007).
- Steensberg, A., Morrow, J., Toft, A. D., Bruunsgaard, H., Pedersen, B. K. Prolonged exercise, lymphocyte apoptosis and F2-isoprostanes. Eur. J. Appl. Physiol. 87, 38-42 (2002).
- Mooren, F. C., Bloming, D., Lechtermann, A., Lerch, M. M., Völker, K. Lymphocyte apoptosis after exhaustive and moderate exercise. J. Appl. Physiol. 93, 147-153 (2002).
- Peters, E. M., Eden, M. V. an, Tyler, N., Ramautar, A., Chutergoon, A. A. Prolonged exercise does not cause lymphocyte DNA damage or increased apoptosis in well-trained endurance athletes. Eur. J. Appl. Physiol. 98, 124-131 (2006).
- Wang, J. -S., Huang, Y. -H. Effects of exercise intensity on lymphocyte apoptosis induced by oxidative stress in men. Eur. J. Appl. Physiol. 95, 290-291 (2005).
- Mooren, F. C., Lechtermann, A., Völker, K. Exercise-induced apoptosis of lymphocytes depends on training status. Med. Sci. Sports Exerc. 36, 1476-1483 (2004).
- Navalta, J. W., Sedlock, D. A., Park, K. -S. Blood treatment influences the yield of apoptotic lymphocytes after maximal exercise. Med. Sci. Sports Exerc. 37, 369-373 (2005).
