Summary
우리는 오랜 기간이 이상의 형광 현미경을 통해 뉴런을 생활에서 mitochondria의 이미징 수있는 프로토콜을 설명합니다. 연장 기간 동안 이미지가 mitochondrially 대상으로 형광 단백질과 설계 및 우리 연구실에 지어진 저렴한 무대 위로 보육의 이용 lentivirus - 중재 표현을 통해 수행됩니다.
Abstract
mitochondrial 교통과의 연결 기능 사이의 관계를 이해하기 위하여, 1-3 연장 기간이 삶의 양식 뉴런의 mitochondrial 행동을 관찰하는 것이 중요합니다. 이것은 cytoskeletal 컴포넌트, organelles, 생활 세포에서 다른 구조 동적 형광 현미경을 통해 시각 다음 표시하고 수있는 중요한 염료와 형광 단백질을 사용하여 지금은 가능합니다. 예를 들어, 배아 닭 교감 신경에 mitochondrial 운동은 중요한 염료 rhodamine 123 4를 사용 특성화했다. 또 다른 연구에서는 mitochondria는 mitochondrially 대상 eYFP 5 transfection하여 쥐 forebrain의 뉴런에서 시각되었습니다. 그러나, 심지어 기본 분 이상의 뉴런, 시간 또는 일의 영상은 문제의 번호를 보여줍니다. 최고 이들 가운데는 다음과 같습니다 긴 영상 세션 동안 같은 온도, 습도, 그리고 산도와 같은 문화 조건 1) 보수, 2) 인수 이미지와 이미지를 분석하는 동안 신호 강도의 정확한 측정의 품질을 모두 보장하는 강력하고 안정적인 형광 신호; 3) 이미지 수집 중에 노출 시간을 제한하는 것은 photobleaching을 최소화하고 phototoxicity을 피할 수 있습니다.
여기, 우리는 관찰, 시각화, 높은 시간적 해상도와 최적의 생활 지원 조건 교양 hippocampal 뉴런의 mitochondrial 운동의 분석을 허용하는 프로토콜을 설명합니다. 우리는 좋은 온도 조절 및 대기 가스 흐름을 제공하는 저렴한 무대 위로 배양기를 구축하고, 또한 안정적인 산도와 osmolarity 추청, 미디어 증발의 정도를 제한합니다. 이 인큐베이터는 일정한 습도 수준 및 5~10%의 CO 2 / 공기의 분위기를 제공하는 표준 조직 문화 배양기에, 유입 및 배출구 호스를 통해 연결되어 있습니다. 이 디자인은 반드시 몇 시간 또는 며칠 동안 세포의 생존을 보장하지 훨씬 더 비싼 현미경 incubators에 비용 효율적인 대안을 제공합니다. mitochondria 시각화하기 위해, 우리는 mitochondrion를 타겟으로하는 적색 형광 단백질을 인코딩 lentivirus와 세포를 감염. 이것은 안정적인 크세논 광원의 사용과 함께, 우리는 이미지 수집 중에 노출 시간을 제한할 수 있으며 제외한 모든 photobleaching과 phototoxicity 걸로, 강하고 지속적인 신호를 보장합니다. 무대 상단 인큐베이터의 상단에 두 사출 포트위한 신경 전달 물질 및 기타 시약의 급성 행정부가 mitochondrial 움직임을 조절하실 수 있습니다. organelle 타겟 빨간색 형광 단백질과 우리 무대 - 최고 인큐베이터, 종래의 거꾸로 형광 현미경, CCD 카메라, 크세논 광원의 조합 합계, lentivirus - 중재 표현은 우리가 mitochondrial 운송 시간이 경과 이미지를 얻기위한 수 종래의 중요한 염료 및 오프 - 더 - 수명 지원 시스템을 배포 연구에서 가능한 그 이상 기간이 이상의 살아있는 뉴런.
Protocol
1. 랩 - 내장 스테이지 - 상단 보육에 대한 설명
2) 환경 대기의 수분 함량을 유지하는 습도 조절, 즉, 3) 문화 매체에 적절한 산도의 유지 1) 주위 온도 제어 및 규제 : 연장 기간이를위한 현미경의 무대에서 살아있는 세포를 유지하는 것은 세 가지 주요 과제를 제공합니다. 이러한 '생명 유지'문제가 교양 뉴런, 온도와 pH의 변화에 특히 민감 세포의 장기적인 관찰과 관련된 실험을 위해 중요하다. 아래, 우리는 설계 및 연장 기간이 이상의 뉴런의 라이브 영상을 위해 만들어진 무대 위로 보육 간단한 실험실 - 내장을 설명합니다. 이 인큐베이터는 10 %의 CO 90분의 2 %의 공기가 안정적인 온수 (37 ° C), humidified 분위기를 제공하는 표준 조직 문화 인큐베이터 (써모 과학, 애쉬빌, NC)에, 폐쇄 회로를 통해 연결되어 있습니다.
- 보육 인클로저 : 보육의 몸 (그림 1 (I, II);)가 검은 delrin 플라스틱의 단단한 조각에서 컴퓨터 C & C 밀링 머신에서 가공되었습니다. 그것은 조치 97.74mm (L) X 73.60mm (W) × 28.58mm (H) (96.74mm의 내부 치수 X 72.60mm X 27.58mm) 약 1만9천3백70cm 3 폐쇄 볼륨을 제공합니다. 두 구멍은 인클로저의 양쪽 끝에 몰락과 /의 조직 문화와 보육에 유입 및 배출구 호스를 수용하기 위해 스레드 황동 바브스가 장착되어 있었다. 70.0mm X 43.0mm를 측정하는 직사각형 오프닝은 폴리 카보 네이트 플라스틱 창 (; B 그림 1 (I, II))의 배치를 허용하도록 인클로저 상단에있는 밖으로 가공된했다. (; C, 그림 1 (I, II, III) 왼쪽 상단에 세부 사항 표시 상위 확인 및 프로파일) 보육의 기본, 16분의 3 "알루미늄 주식에서 가공된은 159.77mm (L) X 109.86mm (W를 측정 ) × 3.175mm (D), 그리고 Leica 전동 내부 스레드 3 - 플레이트 단계 (모델 11-522-068, Leica GmbH를, 라이프 치히, 독일). 푸르 철강 게시물의 삽입 휴회에 맞게 설계된이에 첨부된되었습니다 . 플러시 마운트 플랫 헤드 나사에 의해 thebase의 모서리 이들은 게시물 (그림 1 (II, III), D)에 동의 각 코너에서 몰락되었습니다 보육 인클로저에 대한 견고한 부착 점을 제공합니다. sorbothane 개스 (맥매스터 카, 주식 회사, 엘므허스트, IL) 컷과 인클로저 / 기본 인터페이스에서 도장을 제공하기 위해 기본으로 장착되어되었습니다. 스레딩과 함께 네 황동 thumbscrews가 기본 (그림으로 인클로저를 확보하는 데 사용되는 게시물의 일치 1 (II, III). E,, 왼쪽 상단에 세부 사항); D)은 얇은 recessed 입술 35.1mm 직경의 구멍은 35mm GBMs (그림 1 (III)을 수용하기 위해 인큐베이터 기지의 중심에서 절단되었다 추가 기지 다른 문화 요리 크기를 수용할 수 있도록 설계되었습니다.
- 난방 장치 요소 : 2 인용 10 Kohm 방열판 저항은 (Digi - Key는 주식 회사, 도둑 강 폭포, MN) 보육 인클로저의 내부 벽면에 부착된 있습니다. 이들은 9V DC, Alife 1000W 테라 리 온도 컨트롤러 (카롤 애완 동물 공급, 어모, SC)에 연결되어 500mA 변압기로 입금됩니다. 보육 인클로저의 폴리 카보 네이트 창에서 가스켓을 통해 배치 유선 프로브 내부 주변 온도를 감지하고 저항에 전류 흐름을 결정합니다. 조직 문화 인큐베이터와 함께, 저항은 주위 온도 제어의 추가 측정을 제공합니다.
- 폐쇄 회로 분위기 시스템;에, 10 % CO 90분의 2 %의 공기의 지속 humidified 및 온수 분위기를 제공하기 위해는, 무대 위로 인큐베이터는 입구와 출구 호스 (F, G 그림 1 (I))을 통해 연결되어 표준 물 외피 조직 문화 인큐베이터 (그림 1 (I), H); 견적 과학적 모델 3154, 써모 과학 주식 회사, 애쉬빌, 노스캐롤라이나). (그림 1 (I), F) 그냥 무대 상단 인큐베이터, 유입 호스에 연결하기 전에 표준 수족관 펌프 (; I, Lifegard QuietOne 모델 1200, Pentair 수상, 엘 몬테, CA 그림 1 (I))로 실행 폐쇄 회로를 유지하기 위해 (모델 1150, 펠리칸 제품, 주식 회사, 토랜스, CA,, J 그림 1 (I)) 봉인 ABS 플라스틱 상자에 동봉된되었는지. 이 펌프는 무대 위로 보육에 대한 조직 문화의 인큐베이터에서 지속적인 공기 흐름을 촉진합니다. 펌프에서 무대 위로 인큐베이터로 진동의 전달을 최소화하기 위해 목도리 역할을하고, 펌프 단계 후, 유입 호스는 1500ml Erlenmeyer 플라스크 (K 그림 1 (I))로 실행합니다. 아울렛 호스 (그림 1 (I), G)은 조직 문화 인큐베이터 (그림 1 (I), H)로 무대 위로 인큐베이터에서 선도가,, 동봉된 컴퓨터 팬 (L 그림 1 (I))가 장착되어 있습니다 어떤, 펌프, 또한 지속적인 공기 흐름을 촉진하기위한 것입니다.
- 35mm GBM에 대한 PFTE 막 뚜껑 : 이전 이미징을위한 무대 상단 보육에의 연결을 문화를 배치하는, 35mm의 GBM은 특별한 나와 함께 장착되어있다mbrane 덮개 (그림 1 (II, IV), M, 오른쪽 상단에 표시 세부 사항)이 가스 교환을 허용함과 동시에 문화 매체의 증발을 최소화합니다. 으로 사라진 림 끌었 및 viton 개스킷과 장소에서 개최되어,이 뚜껑은 delrin 플라스틱 림과 PFTE 멤브레인 (미국 Durafilm 유한 주식 회사, 홀리스튼 MA 테플론)의 사전 - 컷 시트로 구성되어 있습니다 delrin 플라스틱 가장자리의 측면을 따라 recessed 채널.
- 사출 포트 : 두 개의 구멍은 무대 상단 인큐베이터의 폴리 카보 네이트 창 (그림 1 (II), 센터 세부, B 근처에 노란색 화살표)로 몰락했다. 스테인레스 스틸 해밀턴 주사기는 주어진 실험 도중 5 - HT, DA, 다양한 수용체 agonists과 antagonists, 기타 시약 관리를위한 사출 포트를 제공하는 끝을 가진 이들은 갖추고 있었다.
2. 기본 Hippocampal 문화의 준비
작품의 모든 중 BSL2 층류 후드 또는 층류 벤치에서 수행됩니다. 기본 hippocampal 뉴런은 표준 절차에 따라 6-7 E18 쥐의 배아로부터 격리하고, 기본 피질 astrocytes로 시설되어 혈청이없는 배지에서 재배하고 있습니다. Glial 세포는 게시 방법 7 따라 준비가되어 있습니다. 에어컨 매체는 낮은 프롤린와 보충 포도당 DMEM (1.76 UG / ML), 아스파라긴 (0.83 UG / ML), 비타민 B12 (0.34 UG / ML), 포도당 (20mM), 지질이 풍부한 BSA (0.5 MG / ML로 구성되어 있습니다 ) 및 B27 8-10의 2 %. 그들의 연결을 유전자 전사 방해가 될 수 있으므로 아무 항생제가 중간에 추가되지 않습니다.
- 폴리 - D - 라이신 (PBS에 0.05 MG / ML)와 35mm 유리 바닥 문화 요리의 중심 유리 coverslip 부분 (GBM)을 커버하고 37 2 시간 동안 서있 떠나 ° C. 폴리 - D - 라이신 솔루션을 기음, BSL2의 층류 후드에 20 분 건조하실 수 있습니다. laminin (PBS에 0.01 MG / ML)와 GBM의 폴리 - D - 라이신 - 코팅 coverslip 부분을 커버하고, 초과 laminin 솔루션을 제거하기 전에 사십분 최소 둡니다. 20 분 동안 별도로 설정합니다.
- E18 쥐 태아의 두뇌에서 hippocampi을 절개하다, 그들과 같이 신경 과학 6 전류 프로토콜에 설명되어 교제를 끊다.
- GBM 당 110,000 세포 밀도 수 있도록 성장 매체에 dissociated 세포를 희석. 당신이 준비할 것이다 GBMs의 숫자에 따라 마스터 믹스에서 세포의 필요한 농도를 계산합니다.
- 37 ° C와 10 %의 CO 90분의 2 %의 공기 분위기 혼합물의 인큐베이터 세트 ATA 온도에 넣어 씨앗 GBMs.
- 2-5 일 후, 추가 arabinoside C (0.14 NG / ML)는 glial 확산을 억제하기 위해 뉴런의 성장 조건에 따라 문화.
- 문화가 lentivirus와 감염되기 전에 두 주 동안 성장을 허용합니다. 이 기간 동안, 모든 삼일 새로운 매체를 사용하여 각 GBM에 매체의 볼륨의 3 분의 1을 교체하십시오. 이 삼투 충격 및 세포 사망을 초래할 수 있으므로, 미디어의 금액을 초과하지 마십시오.
3. 재조합 Lentivirus 인코딩 레드 형광 단백질의 준비
재조합 lentiviruses를 생산을위한 시설을 이용할 필요가 없습니다 조사관의 경우, 상업 법인 예 : 시스템 Biosciences (Mountain View, CA)를하여 맞춤 생산이 옵션입니다.
mitochondrially 타겟 적색 형광 단백질 유전자는 (MitoTurboRFP; Axxora LLC, 샌디에고, CA) 사이토 메갈로 바이러스 주요 즉각 조기 유전자 프로 모터 11 향상제의 transcriptional 통제 자체 운영을 중지시키지 재조합 고양이 면역 결핍 바이러스에 삽입됩니다. 재조합 lentiviruses은 transiently 293T 세포를 transfecting에 의해 생산됩니다.
- PolyJet을 (SignaGen 사용 ~ 75,000 세포 / cm 2, 다음날, 재조합 바이러스 벡터, FIV의 개그와 POL의 유전자, 그리고 기공을 갖는 구염 바이러스 G의 당단백질 유전자를 인코딩 plasmids 공동 transfect 세포의 밀도에 플레이트 293T 세포 실험실, 게이 더 스버그, MD). DNA (4.8 μg 바이러스성 벡터, 플라스미드 4.8 μg의 gagpol 및 플라스미드 2.4 μg VSV G) 12 UG의 총 293T 세포의 모든 10cm 문화 요리에 사용됩니다.
- 24 시간 후에, 잔류 DNA를 제거하는 페놀 레드 무료 행크스 균형 소금 솔루션과 문화 매체 및 세척 세포를 대기음. 50μg/ml 지방질이 풍부한 BSA와 Glutamax와 보충 혈청이없는 신경 기초 매체의 10ml를 추가합니다.
- 다음날, 0.2 미크론 낮은 단백질 바인딩을 필터를 통해 뜨는, 필터를 수확하고 Vivaspin 20 polyethersulfone ultrafiltration의 단위 (Sartorius, 콩코드, 미국)에 추가할 수 있습니다. 순차적으로 70 % 에탄올, 조직 문화 등급 물, 인산 버퍼 식염수에 세척하여 Vivaspin 장치를 사전 처리합니다. 집중 바이러스가 포함된 뜨는 ~ 30 분 1500xg에서 원심 분리하여 50 배. 액체 N 2 나누어지는 바이러스 준비와 저장.
- 집중 바이러스 나누어지는와 쥐 B104 세포를 감염, 72 시간 후에 유동세포계측법에 의해 형광 단백질 발현을 측정하여 바이러스의 금액을 예상하고있다. 긍정적인 세포의 비율은 기본 뉴런의 주어진 숫자에 형광 단백질 발현을 얻기 위해 필요한 농축 바이러스의 바이러스 즉 볼륨의 양을 예측할 수 있습니다.
4. 교양 뉴런의 감염
Hippocampal 신경 세포 배양은 단순히 유동세포계측법 데이터를 기반으로 모든 뉴런의 50 %까지 감염으로 예상 바이러스의 금액을 추가하여 체외에서 십사일에 감염됩니다. 아무 polybrene 사용하지 않습니다. 문화가 형광 단백질 발현을위한 확인하기 전에 3 일간 유지됩니다. 신호가 너무 약한 경우에는 문화가 몇 일 후에 조직 문화와 보육 retested로 반환됩니다.
5. 폐쇄 회로 생활 지원 시스템의 일반 유지 보수
- 적절한 습도를 유지하려면, 보육의 물 재킷이 정기적으로 확인하고 필요한 경우 기입되어 있는지 확인합니다. 물 (25mm 깊이)와 algicide의 작은 볼륨을 포함하고있는 인큐베이터 안에 스테인레스 스틸이나 알루미늄 트레이를 배치해야합니다.
- 필요하면, 캐치 튜브에서 수집한 물을 비우는하여 입구와 보육 분위기 회로의 콘센트 호스의 선택을 취소합니다. 주기적으로 70 % 에탄올로 호스를 플러시.
6. GBM 무대 - 상단 보육에 진학하기 위해 막 뚜껑을 적용
- 전에 무대 위로 인큐베이터 안에 GBM의 배치하는, 조직 문화 후드에있는 멤브레인 덮인 뚜껑이있는 플라스틱 덮개를 교체합니다. 이것이 완료되면, 당신은 현미경으로 덮여 GBM를 이동할 수 있습니다.
- 조심스럽게 좌석 무대 상단 보육의 기초에 recessed 오프닝에서 막 덮인 뚜껑으로 GBM. GBM을 jostling 방지하기 위해, 기본은 현미경의 무대에서 자리에 이미 있는지 확인, 일부 어려움이와 함께 무대에 기본 클립 때문에, 그것은 기지가 위치에 후 GBM을 배치하는 것이 좋습니다.
- 인큐베이터 기지에 철강 게시물 배양기 인클로저를 정렬하고 기지에 인클로저를 낮춥니다. 좋은 도장이 인클로저와 기지 사이의 달성 때까지 thumbscrews를 조이십시오.
7. 이미지 수집
사용 가능한 이미징 소프트웨어 플랫폼의 대부분은 현미경 및 관련 하드웨어의 광범 비교 기능을 가지고 있습니다. 이미지 수집 및 분석 소프트웨어 플랫폼의 다양한 MetaMorph과 같은 Leica 애플 리케이션 스위트, 니콘의 NIS - 요소, 그리고 칼 자이스 혈구 'AxioVision로 현미경의 특정하게 설계 프로그램을 포함하여, 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 이미지 수집 그리고 우리가 Slidebook 5 (지능적인 이미징 혁신, 덴버, CO)를 사용하여 수행된 분석 절차를 설명합니다. 그러나,이 프로토콜에 설명된 각 작업의 구성 단계는 쉽게 다른 프로그램의 다양한 사용에 적용할 수 있습니다.
거꾸로 형광 현미경, 필터 구성, CCD 카메라, 크세논 광원 및 이미징 소프트웨어에 대한 설명
hippocampal 뉴런의 mitochondrial 교통의 역동적인 영상을 위해, 우리는 쿡 Sensicam EQ CCD 카메라 (쿡 장착되어 Leica DMI - 6000B 바뀌 형광 현미경 및 모델 11-522-068 전동 단계를 (Leica 마이크로 시스템즈 CMS GmbH를, Wetzlar, 독일)를 사용 법인, 로물루스, MI), 셔터 람다 10-2 필터 휠 및 컨트롤러 (서터 악기 회사 노바토, CA), 그리고 셔터 DG - 4 300W 크세논 광원. Sedat 쿼드 Beamsplitter 모델 86100bs Leica DM 시리즈 필터, 큐브, 채도 기술에 장착되어, 시각화하는 mitochondria MitoTurbo 레드 형광 단백질이 표시, 우리는 여기와 600nm의 필터 DG - 4 광원 (피크에서 555nm 필터의 조합을 사용 주식 회사는 방출을 위해, 각각 현미경 및 필터 바퀴에서 폭포, VT)와 617nm 벨로우즈.
이미지 수집 및 분석을위한, 우리는 디지털 현미경 이미징 소프트웨어 패키지를 Slidebook 5를 사용합니다. 이것은 현미경, 무대, 필터 휠, 카메라, 광원 이미지 수집하는 동안뿐만 아니라, 영상 처리 및 분석 모듈의 다양한 완전 자동화된 제어를 허용하는 포괄적인 패키지입니다.
아래, 우리는 Slidebook 5를 사용하고 찬란 분류 뉴런의 이동 mitochondria의 시간 경과 이미지를 취득 특정 단계별 지침을 제공합니다.
- 현미경, 필터 휠 컨트롤러, 광원과 CCD 카메라 Slidebook 5 열기 전에 설정되어되었는지 확인하십시오.
- mitochondria의 라이브 영상을 보려면 (무대, 63X 오일 침지 목표 스위치 현미경 단계 아래의 목적에 대한 액세스를 제공하기 위해 충분히 객관적인 터릿을 낮출) 인큐베이터 - 맨, 그리고 조심스럽게 목적의 표면에 직접 기름을 적용합니다. Slidebook 도구 모음에서 '초점 윈도우'아이콘을 클릭하여 포커스 창을 엽니다. 초점 창에서 적당한 수준으로 브라이트 강도를 조정하는 '램프'라는 슬라이더를 슬라이딩하여 브라이트 램프를 켭니다. 세포 분야에 초점을 취득하고 관심 세포를 찾으십시오.
- '범위'탭에서 'CY3'플루어을 선택합니다. 형광등 조명 아래 oculars를 사용하면 미토 TurbRed 단백질로 분류되었습니다 세포의 mitochondria에 대한 초점 비행기를 찾으십시오. 당신이 oculars를 통해 포커스를 얻었을하면, CCD 카메라로 전환하고 다시 취득 초점이 필요한 경우.
- Slidebook 도구 모음에서 '이미지 캡처'아이콘을 클릭하여 이미지를 캡처 창을 엽니다. 또는, 당신이 '일단'버튼을 사용할 수 있습니다 100ms의 초기 노출 시간과 시작, '테스트'와 버튼 '최고 찾기'를 사용하여 최적의 노출 시간을 찾으십시오. (; 이미지 캡쳐 윈도우의 하단에 히스토그램으로 표시 예 : 0-2500) 최소 기간 이내 (예 : 200 - 800ms)는 노출 시간이 전체 이미지 들판을 가로질러 확산 충분한 강도를 제공해야 기억하십시오.
- 시간 저속 이미지 획득을 시작하기 전에, 이미지 캡처 창 내에 여전히 '고급'탭을 클릭하여 '고급'창을 엽니다. '초점'탭을 찾아 time-lapse/multipoint 캡처 '옵션 중'Autofous '를 확인하고 시간 저속 이미지 수집을위한 자동 초점 설정을 조정합니다. 일반적으로, 우리는 자동 초점을 위해 다음과 같은 매개 변수를 사용 : 매주 2-3 프레임에 초점을 업데이트, 총 검색 범위 63x 배율 2 음, 이미징에 사용되는 자동 초점 채널 플루어가 mitochondria, 즉 CY3 표시로 선택합니다.
- '캡쳐'창에서 '캡쳐 형식'상자에서 'Timelapse'옵션을 체크하고 'Timelapse 캡처'옵션에 따라 이미지 세션 원하는 이미지 간격과 기간을 선택합니다. mitochondrial 교통 neuromodulators의 효과 우리의 연구에서, 시간 경과 영상 360 이미지의 전체가 이미지 사이의 10초 간격으로 취득한되었던 한 시간 세션에서 수행되었다.
- '캡쳐'창이의 하단, 오른쪽에있는 '시작'버튼을 클릭하여 시간 저속 이미지 수집을 시작합니다.
- 초기 또는 제어, 영상 세션 후, 무대 위로 인큐베이터의 상단에 포트를 통해 신경 전달 물질 및 기타 시약을 관리하고 새로운 이미징 세션을 시작합니다.
8. 이미지 분석
- 마지막 이미지 세션 후 저장된 이미지 파일을 엽니다.
- 개인 mitochondria는 Slidebook 5 제공된 마스킹 기능을 채용하여 중 자동 또는 수동으로 시간 촬영된 이미지 시리즈의 표시 수 있습니다.
- '마스크'메뉴에서 메뉴 표시줄에서 '세그먼트'를 선택합니다. , '히스토그램'도구의 낮은 높은 임계값 라인 슬라이딩 전체 이미지에서 파란색으로 모든 입자를 마스킹, 그 과정에서 포함된 모든 mitochondria를 덮고 있지만, 가능한 이산 입자를 떠나하여. 전체 이미지 시리즈에 마스크를 적용합니다.
- 입자가 이전 마스크에 의해 강조되어있는 관심의 과정을 제외하고 전체 이미지를 포함 두 번째 마스크를 ( '마스크'메뉴에서 '만들기'를 선택)를 만듭니다. 이것은 경계 지역을 기입에있는 '페인트 통'도구를 사용하여 다음 과정 이외의 영역의 경계를 추적,하고 두꺼운 '연필'도구를 사용하여, 먼저 수행됩니다. 전체 이미지 시리즈이 마스크를 적용하십시오.
- 아래의 '마스크'선택 '마스크 운영'과 '마이너스'작업, 즉 수행은 두 번째 마스크는 주먹 마스크 (프로세스를 제외하고 전체 이미지)에서 빼서입니다. 세 번째 마스크가있는 관심에만 프로세스가 강조 생성됩니다. 이 새로운 마스크는 전체 이미지 시리즈에 적용됩니다.
- 아래의 '주석'을 선택 '개체 ID가.
- 연속성 및 개인의 숫자로 할당 수동으로 이미지 시리즈 검토하여 mitochondria를 가면 확인 (Slidebook 5, '놀이', '앞으로 프레임'과 '역방향 프레임을 이미지 창 아래'버튼이 목적을 위해 사용할 수 있습니다.)
- 메뉴 막대에서 '마스크'탭을 선택합니다. 아래의 '마스크'선택 '입자 추적'하고 실행 '기본 입자 추적'은 각각의 가면을 쓰고 mitochondrion에 대한 중심의 좌표를 포함하여 '경로 통계'를 생성합니다.
- 거리 두 인접 이미지 프레임 사이에 각 mitochondrion에 의해 여행은 각 프레임에서 각 입자의 좌표에서 계산됩니다.
- mitochondrial 운동 neuromodulators의 효과 우리의 이전 연구에서 우리는 세 개의 서로 다른 mitochondria의 인구 확인 :. directionally 이동 '고정', 'oscillatory'및 '을' mitochondrion이 (63X 배율 이하 또는 2 픽셀, 1 픽셀 = 0.10235 음) 미만 0.2 음 여행하면 한 시간 이내, 그것은 같은 것이 특징입니다 '고정. mitochondrion 적어도 0.2 음,하지만 미만 2 이동하십시오.5 음은 anterograde - 역행주기에, 그것은으로 정의됩니다 'oscillatory. mitochondrion 한 방향 이상의 2.5 음의 그물 거리를 여행하는 경우 directionally 이동으로 마지막으로, 그것은 분류됩니다. 그림 2에서 묘사된 것은 대표적인 실험뿐만 아니라, mitochondria의 세 가지 독특한 인구의 비율 분포를 보여주는 원형 차트에있는 모든 레이블 mitochondria의 움직임을 보여주는 히스토그램이다.
- 각 mitochondrion의 평균 속도는 주어진 영상 세션 동안 여행을 총 거리에 따라 계산됩니다. mitochondrial 인구의 평균 속도는 각각의 속도를 추가하고 추적할 수 mitochondria의 총 수로 나누어 계산합니다.
- Kymographs는 Slidebook 5 제공된 모듈을 사용하여 생성할 수 있습니다. '마스크'기능 사용 특정 프로세스 (예 : 축삭)의 전체 범위에 걸쳐 얇은 선을 그릴, 가능한 많은 mitochondrial centroids로 통과해야합니다. '고급 작업'메뉴 막대를 선택에서 '마스크'탭으로 이동 후 '부드러운 곡선 분석. 부드러운 곡선 분석에 대한 기본 설정을 사용하거나 원하는대로 사용자 정의하십시오. 부드러운 곡선 분석 모듈을 실행합니다. 분석의 끝에, 이미징 세션 kymograph가 표시됩니다.
- '내보내기 TIFF.'다음 메뉴 모음으로 이동하고 '보기'와
- 포토샵에서 kymograph을 포함하는 저장된. TIF 파일이나 유사한 이미지 프로세싱 프로그램을 열고 거꾸로 이미지를 변환 그레이 스케일.
9. 대표 결과
추적 및 교양 hippocampal 뉴런의 mitochondrial 움직임을 분석함으로써, 우리는 neuromodulation과 mitochondrial 인신 매매 사이의 링크를 증명하고있다. 특히, 우리는 그 세로토닌 (5 - HT) 또는 5 HT1A 수용체 작용제, 8 - OH - DPAT을 발견 도파민 (DA) 또는 D2 수용체 작용제, bromocriptine이 억제 반면 mitochondrial 운동 (그림 2A - C) 8, 자극 mitochondrial 운동 (그림 2D - G) 9.
그림 1. 폐쇄 회로 무대 위로 보육 시스템의 설계 보육 시스템의 다음과 같은 구성 요소가 표시됩니다 : 내열성 delrin 플라스틱 인클로저 (A), 폴리 카보 네이트 플라스틱 창에 대한 직사각형 개방 (B), 보육 (C)의 알루미늄 기지, 구멍. 베이스 (D)의 철강 게시물을 수락, 인큐베이터 기지의 중심에 얇은 recessed 입술 35.1mm 직경 구멍 35mm GBM 요리 (E)을 수용, nalgene 호스 (조직 문화와 무대 위로 incubators 사이의 연결, 수분 트랩) ( F, G, N); 조직 문화 인큐베이터 (H), 수족관 펌프 (I), 빵빵한 ABS 플라스틱 상자 (수족관 펌프 주택) (J) 2000ml Erlenmeyer 플라스크 (호스의 진동 억제를위한 머플러 무대 맨 앞에 인큐베이터) (K), 냉각 팬 (L)에 대한 플라스틱 인클로저, 35mm GBM의 뚜껑 플라스틱 프레임 (M), 플라스틱 stopcocks의 위치 (O). 시약의 관리를위한 포트의 위치는 (II)에 노란색 화살표로 표시됩니다.
그림 2. 대표 결과 :. mitochondrial 교통 A. 규제 문화의 전형적인 쥐 hippocampal 신경 세포의 축삭. lentivirus 인코딩된 형광 단백질로 분류 Mitochondria은 녹색으로 표시되며 phospho - neurofilament 항체와 immunolabeled axons은 빨간색으로 표시됩니다. 축삭의 범위는 노란색 화살촉으로 표시됩니다. 이미지가 네 중복 micrographs 구성되어 있습니다. 5 - HT의 관리 후 mitochondrial 운동의 변화를 보여주는 시간 촬영된 이미지 시리즈의 B. 예. 이미지가 거꾸로 형광 현미경을 통해 취득한 후에 퀵타임 무비로 변환되었습니다 시퀀스로 저장되었습니다. 이미지의 대표 순서가 표시되기 전에 여러 시간 지점 (왼쪽 패널)와 8 - OH - DPAT, 5 HT1A 수용체 작용제의 후 (오른쪽 패널) 관리에서 개별 mitochondria. 수직 빨간색 사각형은 고정 mitochondrion (왼쪽)와 여러 시간 동안 포인트 oscillatory mitochondrion을 (오른쪽) 하이라이트. (왼쪽 패널) 표시 oscillatory mitochondrion는 8 - OH - DPAT (; 빨간 국경을 마주하고 하얀 화살촉 오른쪽 패널)과 치료 후 축삭 터미널쪽으로 이동합니다. 수직 노란색 라인 (오른쪽 패널)은 이동 mitochondrion의 시작 위치를 나타냅니다. 시간 간격은 각 프레임의 오른쪽 하단에 표시됩니다. 확대 (63 ×)이 오른쪽 패널의 오른쪽 하단 모서리에 표시됩니다. C, 5 - HT의 관리 후 mitochondrial 운동의 변화를 보여주는 D. 플로츠. 이전 mitochondrial 운동의 변경 (C)와 (D) 5 HT의 관리는 축삭 (Y 축)을 따라 속도의 플롯 (X 축) 대 개인 mitochondria의 초기 위치로 제시 후. 속도와 고정 (적색), oscillatory (파란색), 그리고 directionally 이동 (녹색) M의 비율itochondria는 줄거리 각각 파이 차트 (플롯 위에 insets)에 표시됩니다. 각각의 음모를 Y 축에 만화 축삭의 하이라이트 지역에서 돌출 빨간 점선이 몇 군데 있던 축삭 세그먼트의 대략적인 위치와 범위를 나타냅니다. E, DA의 관리 후 mitochondrial 운동의 변화를 보여주는 F. 플로츠. 이전 mitochondrial 운동의 변화 (E)와 (F) 검찰의 관리는 축삭 (Y 축)을 따라 속도의 플롯 (X 축) 대 개인 mitochondria의 초기 위치로 제시 후. 의 속도와 비율 고정 (적색), oscillatory (파란색), 그리고 directionally 이동 (녹색) mitochondria가 각각 플롯와 파이 차트 (플롯 위 insets)에 표시됩니다. 각각의 음모를 Y 축에 만화 축삭의 하이라이트 지역에서 돌출 빨간 점선이 몇 군데 있던 축삭 세그먼트의 대략적인 위치와 범위를 나타냅니다. G, 전에 교양 신경 세포에 mitochondrial 움직임을 보여주는 H. 대표 kymographs (G) 및 이후 (H) D1R 수용체 작용제, bromocriptine의 관리. 신경 세포는 bromocriptine의 (G) 한 다음 시간 (H) 관리 한 시간 전에 대한 몇 군데했다.
Discussion
lentivirus - 중재 감염 교양 뉴런에서 mitochondria를 타겟으로하는 형광 단백질의 표현과 연장 기간이 살 세포의 이미징을 허용 저렴한 실험실 지은 무대 위로 배양기를 채용, 우리는 mitochondrial 운동 neuromodulatory 신호 사이의 링크를 조사할 수있다 , 세로토닌 (5 - HT), 도파민 (DA) 및 아세틸콜린 (ACH) 등. 신경 기능의 핵심입니다 - 우리의 연구는 처음으로, 이러한 5 - HT 및 DA 같은 신경 전달 물질에 의해 뉴런 - 변조된의 활동의 변화에 mitochondrial 거래를 링크, 신호 경로를 명료하게하다하는 데 도움이 있습니다. 우리는 대상 단백질 형광의 사용이 더 생리학 관련 중요한 염료를 사용 가능 훨씬 짧은 기간이 아닌 수 있습니다 오랜 기간 동안 교양 뉴런을 살아가 표시 mitochondria의 관찰을 허용 것을 발견했습니다. 또한, 형광 단백질 신호의 강도가 photobleaching 또는 phototoxicity의 가능성을 최소화, 우리는 이미지 수집 중에 노출 시간 간단하게 할 수 있습니다. 마지막으로, 간단하고 저렴한 무대 위로 인큐베이터 미디어의 증발을 최소화하면서, 주위 온도, 습도 및 CO 2 수준을 유지, 우리도 시간 또는 일 동안 뉴런을 생활에 mitochondrial 운동을 수행 할 수 있습니다. 라이브 뉴런에서 mitochondria의 장기적인 관찰을위한 무대 위로 배양기를 조작하고자하는 연구자를 제공, 우리 디자인의 정확한 세부 사항을 수행하지 않아도되는 미디어의 증발을 방지하기 위해 (예를 들어, 가스 투과 막을 사용하는 재료의 성질 )과 (예, 온도 및 습도 제어, osmolarity의 산도, 유지 보수 버퍼링) 적용 원칙은 일반적으로이 프로토콜에서 설명하는 것과 일치합니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 무대 위로 배양기의 설계 및 제조하는 동안 자신의 기술 전문 지식과 훌륭한 기술을 공헌에 대한 도널드 헛슨 감사하고 싶습니다. 우리는 그녀의 뛰어난 기술 지원에도 Ayda Dashtaei에게 감사하고 있습니다. 모든 작품은 Neurosciences 학술 진흥 재단에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (1) Tissue culture incubator (H) | |||
| (1) Heat-resistant plastic enclosure (A) | (delrin or comparable) | ||
| (1) Plastic frame for 35mm GBM lid (M) | (for affixing membrane to petri dish) | ||
| (1-2) linear ft. Clear PFTE (Teflon) | membrane material | ||
| (4) Brass thumb screws | |||
| (2) Small 10kOhm heatsink resistors | used as heating elements inside stage-top incubator enclosure | ||
| (1) Transformer | supply of 9V current to resistors | ||
| (1) Terrarium temperature controller and probe | thermostatic regulation of power to heatsink resistors via transformer | ||
| (1) 2000ml Erlenmeyer flask (K) | muffler for vibration suppression in hose before stage-top incubator | ||
| (1) 1/8" sorbothane sheet | gasket material for base of stage-top incubator | ||
| (1) Airtight ABS (or comparable) plastic box (J) | housing for aquarium pump | ||
| (1) Aquarium pump (I) | |||
| (1) Small computer cooling fan | |||
| (1) Plastic enclosure for cooling fan (L) | |||
| (1) 9V transformer for computer cooling fan | |||
| (20-30ft) Nalgene or silicone hose (F,G,N) | connections between tissue culture and stage-top incubators; moisture traps | ||
| (2) Plastic stopcocks (O) | to open and close air flow before and after stage-top incubator | ||
| (4) Barbed brass hose connectors | for hose connections to/from stage-top incubator and aquarium pump enclosure | ||
| (2) Brass quick couplers | for hose connections to/from stage-top incubator | ||
| (2) Brass quick couplers | for hose connections to/from stage-top incubator | ||
| Table 1. Stage-top incubator parts: | |||
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | |
| laminin | Roche Group | 11243217001 | |
| 35 mm glass-bottom dishes | MatTek Corp. | P35GC-0-14-C | |
| DMEM | Life Technologies | 10567 | |
| B27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050 | |
| Lipid-rich BSA | Life Technologies | 11020-021 | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | P0380-100G | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | A8381-100G | |
| Vitamin B-12 | Sigma-Aldrich | V2876-100MG | |
| 5-HT | Sigma-Aldrich | H9523-25MG | |
| 8-OH-DPAT | Sigma-Aldrich | H8520-25MG | |
| Dopamine | Sigma-Aldrich | H8502-5G | |
| Bromocriptine | Sigma-Aldrich | B2134-25MG | |
| SKF38393 | Sigma-Aldrich | D047-100MG | |
References
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