Demonstratie van het gebruik van de Novel zwaartekracht Spectrometer te rekken en te meten Stapel-eiwitten
Summary
Dit is een stap-voor-stap handleiding toont het doel, de werking, en representatieve resultaten van de roman zwaartekracht spectrometer.
Abstract
De studie van macromoleculaire structuur is geworden van cruciaal belang voor het ophelderen van de moleculaire mechanismen en functie. Er zijn verschillende beperkte, maar belangrijke bioinstruments geschikt voor het testen van de kracht afhankelijkheid van structurele kenmerken in eiwitten. Schaal is een beperkende parameter over hoe nauwkeurig onderzoekers kunnen peer in de nanomechanical wereld van moleculen, zoals nucleïnezuren, enzymen, en de motor eiwitten die levensverlengend werken uit te voeren. Atomaire kracht microscopie (AFM) is goed afgestemd op eigen structuren van de vezelachtige eiwitten te bepalen met een resolutie van afstand op gelijke voet met elektronenmicroscopie. Echter, in AFM kracht studies, de krachten zijn meestal veel hoger dan een enkel molecuul kan ervaring 1, 2. Optische vallen (OT) zijn erg goed in het bepalen van de relatieve afstand tussen de kralen opgesloten en ze kunnen overbrengen zeer kleine krachten 3. Echter, ze niet toegeven accurate absolute lengte van de moleculen onder studie. Moleculaire simulaties geven ondersteunende informatie om dergelijke experimenten, maar zijn beperkt in de mogelijkheid om het dezelfde grote moleculaire afmetingen, lange tijd frames, handvat en overtuigen sommige onderzoekers in de afwezigheid van andere bewijsstukken 2, 4.
De zwaartekracht spectrometer (GFS) vult een kritische niche in het arsenaal van een onderzoeker door middel van een unieke combinatie van vaardigheden. Dit instrument is in staat om het genereren van krachten meestal met 98% of beter nauwkeurigheid van de femtonewton reeks tot de nanonewton bereik. De afstand metingen op dit moment in staat zijn om het oplossen van de absolute moleculaire lengte tot vijf nanometer, en de relatieve kraal paar afstanden met een precisie die vergelijkbaar met een optische val. Ook kan het GFS bepalen uitrekken of afrollen waar de kracht ligt in de buurt evenwicht, of een gegradeerde kracht om naast elkaar tegen alle gemeten structurele veranderingen. Het is zelfs mogelijk om te bepalen hoeveel aminozuur residuen zijn betrokken bij het afrollen gebeurtenissen onder fysiologische kracht belastingen 2. In tegenstelling tot in andere methoden waar sprake is van een uitgebreide kalibratie van kracht dat elke test moet voorafgaan, de GFS vereist geen zo'n kracht kalibratie 5. Door het aanvullen van de sterke punten van andere methoden, zal het GFS brug hiaten in het begrijpen van de Nanomechanica van vitale eiwitten en andere macromoleculen.
Protocol
Discussion
Bij het omzetten van een film naar een digitaal thresholded voorstelling, is het cruciaal voor de thresholded afbeelding om het hetzelfde gebied in elk frame van de video te behouden. Omdat de kralen in een kraal paar bewegen onafhankelijk van elkaar, kan een eventuele verschuiving in de thresholded gebieden ook de oorzaak van de relatieve afstanden tussen de hartlijnen van de kralen te drijven en de invoering van belangrijke fouten. Het beheersen van de drempel gebied verminderde de fout vijfvoudige in de verte metinge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit materiaal is gebaseerd op werk ondersteund door de National Science Foundation onder Grant nummer 0842736.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 3-Aminopropyltriethoxysilane | Poly Sciences | 919-30-2 | ||
| Acetone | Fisher Scientific | A18P-4 | ||
| Pyridine | Sigma Aldrich | 110-86-1 | ||
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | G7776 | ||
| Glycine | Research Organics | BP381-1 | ||
| Tris | Sigma | 9682T | ||
| Sodium azide | Amresco | 71289 | ||
| BSA | Sigma Aldrich | AMR-0332-100G | ||
| NaCl | Sigma | S7653 | ||
| EDTA | MSI | E9884 | ||
| Nitrocellulose | Sigma | 60443 | ||
| N-N Dimethyl Formamide | Extracted from Large New | D4254 | ||
| Rabbit skeletal myosin II | Zealand White Rabbits (7-8) | NA | ||
| MF30 antibody (9-10) | Developmental Studies | MF30 | ||
| MF20 antibody (6) | Hybridoma Bank | MF20 | ||
| Lab microscope | Boreal | WW57905M00 | ||
| Equatorial mount | Celestron | CG-5 | ||
| Digital video cam | Sony | XCDV60 | ||
| Caliper release | Cabelas | IA-415482 | ||
| Compression spring | Jones Spring Co. | 723 | ||
| Extension spring | Jones Spring Co. | 770 | ||
| ImageJ | NIH | NA | ||
| Fire-i drivers & application | Unibrain | 3.80 | ||
| Excel | Microsoft | NA |
References
- Schwaiger, I., Sattler, C., Hostetter, D. R., Rief, M. The myosin coiled-coil is a truly elastic protein structure. Nat. Mater. 1, 232-235 (2002).
- Root, D. D., Yadavalli, V. M., Forbes, J. G., Wang, K. Coiled-coil nanomechanics and uncoiling and unfolding of the superhelix and alpha-helices of myosin. Biophysical Journal. 90, 2852-2866 (2006).
- Nishizaka, T., Miyata, H., Yoshikawa, H., Ishiwata, S., Kinosita, K. Unbinding force of a single motor molecule of muscle measured using optical tweezers. Nature. 377, 251-254 (1995).
- Gawalapu, R. K., Root, D. D. Fluorescence labeling and computational analysis of the strut of myosin’s 50 kDa cleft. Arch. Biochem. Biophys. 456, 102-111 (2006).
- Kellermayer, M. S. Z. Visualizing and manipulating individual protein. Molecules Physiol. Meas. 26, R119-R153 (2005).
- Shimizu, T., Dennis, J. E., Masaki, T., Fischman, D. A. Axial arrangement of the myosin rod in vertebrate thick filaments: immunoelectron microscopy with a monoclonal antibody to light meromyosin. J. Cell Biol. 101, 1115-1123 (1985).
- Godfrey, J. E., Harrington, W. F. Self-association in the myosin system at high ionic strength. I. Sensitivity of the interaction to pH and ionic environment. Biochemistry. 9, 886-893 (1970).
- Root, D. D., Stewart, S., Xu, J. Dynamic docking of myosin and actin observed with resonance energy transfer. Biochemistry. 41, 1786-1794 (2002).
- Xu, J., Root, D. D. Conformational Selection during Weak Binding at the Actin and Myosin Interface. Biophys. J. 79, 1498-1510 (2000).
- Sattin, B. D., Pelling, A. E., Goh, M. C. DNA base pair resolution by single molecule force spectroscopy. Nucleic Acids Res. 32, 4876-4883 (2004).
