הדגמת שימושים של ספקטרומטר הכבידה רומן כוח כדי למתוח מדוד חלבונים סיביים
Summary
זהו צעד אחר צעד מדריך המציג את המטרה, תפעול, והתוצאות נציג ספקטרומטר כוח הכבידה הרומן.
Abstract
המחקר של מבנה macromolecular הפך קריטי הבהרה של המנגנונים המולקולריים ותפקוד. יש bioinstruments מוגבל, אבל חשוב כמה מסוגל לבחון את התלות של תכונות כוח חלבונים מבניים. סולם כבר פרמטר הגבלת כיצד במדויק החוקרים יכולים להציץ לתוך העולם nanomechanical של מולקולות, כגון חומצות, אנזימים גרעין, חלבונים מנוע המבצעים של חיים עבודה. מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) הוא מכוון היטב כדי לקבוע מבנים יליד חלבונים סיביים עם רזולוציה מרחק שוה עם מיקרוסקופ אלקטרונים. עם זאת, מחקרים AFM כוח, הכוחות הם בדרך כלל הרבה יותר גבוה מאשר מולקולה בודדת עשוי להיתקל 1, 2. מלכודות אופטי (OT) טובים מאוד לקבוע את המרחק היחסי בין חרוזים לכודים והם יכולים להקנות כוחות קטנים מאוד 3. עם זאת, הם אינם אורכים תשואה אבסולוטית מדויק של מולקולות הנחקרת. סימולציות מולקולרית לספק מידע תומכת ניסויים כאלה, אבל הם מוגבלים ביכולת להתמודד עם גדלים באותו מולקולרי גדול, מסגרות זמן רב, לשכנע כמה חוקרים בהעדר ראיות תומכות אחרות 2, 4.
ספקטרומטר כוח הכבידה (GFS) ממלא נישה קריטי בארסנל של חוקר על ידי מתן שילוב ייחודי של יכולות. מכשיר זה היא מסוגלת לייצר כוחות בדרך כלל עם 98% או יותר דיוק מטווח femtonewton לטווח nanonewton. מדידות מרחק כיום מסוגלים לפתור את אורך מולקולרית מוחלטת עד חמישה ננומטרים, ויחסי חרוז ההפרדה זוג מרחקים עם דיוק דומה מלכודת אופטי. כמו כן, GFS יכול לקבוע מתיחה או ומתעקל שבו הכוח נמצא ליד שיווי משקל, או לספק כוח מדורגים הצבתם נגד שינויים מבניים נמדד. אפשר אפילו לקבוע כמה שאריות חומצת אמינו מעורבים ומתעקל אירועים תחת עומסים כוח פיזיולוגי 2. בניגוד לשיטות אחרות שבהם יש כוח רב כי כיול חייבת להקדים כל assay, GFS לא דורש כיול כוח כזה 5. על ידי המשלימה את החוזק של שיטות אחרות, GFS יהיה לגשר על פערים בהבנת Nanomechanics של חלבונים חיוניים מקרומולקולות אחרים.
Protocol
Discussion
בעת המרת סרט ייצוג thresholded דיגיטלית, זה קריטי עבור התמונה thresholded לשמור על אותו אזור בכל מסגרת של וידאו. מכיוון חרוזים בזוג חרוז לנוע באופן עצמאי זה מזה, כל להיסחף בתחומים thresholded יכול גם לגרום המרחקים היחסית בין centroids של החרוזים להיסחף ולהציג טעות משמעותית. שליטה על אזור ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
חומר זה מבוסס על עבודה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע תחת גרנט מס '0842736.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 3-Aminopropyltriethoxysilane | Poly Sciences | 919-30-2 | ||
| Acetone | Fisher Scientific | A18P-4 | ||
| Pyridine | Sigma Aldrich | 110-86-1 | ||
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | G7776 | ||
| Glycine | Research Organics | BP381-1 | ||
| Tris | Sigma | 9682T | ||
| Sodium azide | Amresco | 71289 | ||
| BSA | Sigma Aldrich | AMR-0332-100G | ||
| NaCl | Sigma | S7653 | ||
| EDTA | MSI | E9884 | ||
| Nitrocellulose | Sigma | 60443 | ||
| N-N Dimethyl Formamide | Extracted from Large New | D4254 | ||
| Rabbit skeletal myosin II | Zealand White Rabbits (7-8) | NA | ||
| MF30 antibody (9-10) | Developmental Studies | MF30 | ||
| MF20 antibody (6) | Hybridoma Bank | MF20 | ||
| Lab microscope | Boreal | WW57905M00 | ||
| Equatorial mount | Celestron | CG-5 | ||
| Digital video cam | Sony | XCDV60 | ||
| Caliper release | Cabelas | IA-415482 | ||
| Compression spring | Jones Spring Co. | 723 | ||
| Extension spring | Jones Spring Co. | 770 | ||
| ImageJ | NIH | NA | ||
| Fire-i drivers & application | Unibrain | 3.80 | ||
| Excel | Microsoft | NA |
References
- Schwaiger, I., Sattler, C., Hostetter, D. R., Rief, M. The myosin coiled-coil is a truly elastic protein structure. Nat. Mater. 1, 232-235 (2002).
- Root, D. D., Yadavalli, V. M., Forbes, J. G., Wang, K. Coiled-coil nanomechanics and uncoiling and unfolding of the superhelix and alpha-helices of myosin. Biophysical Journal. 90, 2852-2866 (2006).
- Nishizaka, T., Miyata, H., Yoshikawa, H., Ishiwata, S., Kinosita, K. Unbinding force of a single motor molecule of muscle measured using optical tweezers. Nature. 377, 251-254 (1995).
- Gawalapu, R. K., Root, D. D. Fluorescence labeling and computational analysis of the strut of myosin’s 50 kDa cleft. Arch. Biochem. Biophys. 456, 102-111 (2006).
- Kellermayer, M. S. Z. Visualizing and manipulating individual protein. Molecules Physiol. Meas. 26, R119-R153 (2005).
- Shimizu, T., Dennis, J. E., Masaki, T., Fischman, D. A. Axial arrangement of the myosin rod in vertebrate thick filaments: immunoelectron microscopy with a monoclonal antibody to light meromyosin. J. Cell Biol. 101, 1115-1123 (1985).
- Godfrey, J. E., Harrington, W. F. Self-association in the myosin system at high ionic strength. I. Sensitivity of the interaction to pH and ionic environment. Biochemistry. 9, 886-893 (1970).
- Root, D. D., Stewart, S., Xu, J. Dynamic docking of myosin and actin observed with resonance energy transfer. Biochemistry. 41, 1786-1794 (2002).
- Xu, J., Root, D. D. Conformational Selection during Weak Binding at the Actin and Myosin Interface. Biophys. J. 79, 1498-1510 (2000).
- Sattin, B. D., Pelling, A. E., Goh, M. C. DNA base pair resolution by single molecule force spectroscopy. Nucleic Acids Res. 32, 4876-4883 (2004).
