Demostrando la Utilización del Espectrómetro de Novela de la Fuerza gravitacional para estirar y medir las proteínas fibrosas
Summary
Se trata de un paso a paso guía que muestra el propósito, el funcionamiento y los resultados representativos de la fuerza de la gravedad del espectrómetro novela.
Abstract
El estudio de la estructura macromolecular ha convertido en crítico para la elucidación de los mecanismos moleculares y la función. Hay varios bioinstruments limitada, pero importante, capaz de probar la dependencia de la fuerza de las características estructurales de las proteínas. Escala ha sido un parámetro de limitación en la precisión investigadores pueden mirar en el mundo nanomecánicos de moléculas, tales como ácidos nucleicos, enzimas y las proteínas motoras que realizan para mantener la vida de trabajo. Microscopía de fuerza atómica (AFM) está bien afinado para determinar las estructuras nativas de proteínas fibrosas con una resolución de la distancia a la par con el microscopio electrónico. Sin embargo, en estudios de AFM fuerza, las fuerzas son generalmente mucho mayor que una sola molécula puede experimentar 1, 2. Trampas ópticas (OT) son muy buenos en la determinación de la distancia relativa entre los granos atrapados y pueden transmitir fuerzas muy pequeñas 3. Sin embargo, no precisa el rendimiento longitud absoluta de las moléculas bajo estudio. Simulaciones moleculares proporciona información de apoyo para estos experimentos, pero están limitados en la capacidad de manejar el mismo de gran tamaño molecular, cuadros de largo tiempo, y convencer a algunos investigadores, en ausencia de otras pruebas de apoyo 2, 4.
La fuerza gravitacional del espectrómetro (GFS) llena un nicho importante en el arsenal de un investigador al ofrecer una combinación única de habilidades. Este instrumento es capaz de generar fuerzas típicamente con un 98% o mayor precisión de la gama femtonewton a la gama nanonewton. Las mediciones de distancia en la actualidad son capaces de resolver la longitud molecular absoluta a cinco nanómetros, y la relativa distancia de separación de cuentas par con una precisión similar a una trampa óptica. Además, la GFS puede determinar el estiramiento o desenrollar en donde la fuerza está cerca del equilibrio, o proporcionar una fuerza gradual de yuxtaponer contra cualquier cambio estructural medido. Incluso es posible determinar el número de residuos de aminoácidos están involucrados en desenrollar eventos bajo cargas de fuerza fisiológica 2. A diferencia de otros métodos de calibración donde hay fuerza amplia que debe preceder a cualquier ensayo, el GFS no requiere de calibración tal fuerza 5. Al complementar las fortalezas de otros métodos, la EFP cerrar las brechas en la comprensión de la nanomecánica de proteínas vitales y otras macromoléculas.
Protocol
Discussion
Al convertir una película a una representación digital de un umbral, es crucial para la imagen de un umbral para mantener la misma área en cada fotograma de vídeo. Debido a que las cuentas en un par de bolas se mueven independientemente uno del otro, la deriva en las áreas de un umbral también puede causar la distancia relativa entre los centroides de las cuentas a la deriva y introducir un error considerable. El control de la zona del umbral reducido el error de cinco veces en las mediciones de distancia de 26 nm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este material está basado en trabajo apoyado por la National Science Foundation con la subvención No. 0842736.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 3-Aminopropyltriethoxysilane | Poly Sciences | 919-30-2 | ||
| Acetone | Fisher Scientific | A18P-4 | ||
| Pyridine | Sigma Aldrich | 110-86-1 | ||
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | G7776 | ||
| Glycine | Research Organics | BP381-1 | ||
| Tris | Sigma | 9682T | ||
| Sodium azide | Amresco | 71289 | ||
| BSA | Sigma Aldrich | AMR-0332-100G | ||
| NaCl | Sigma | S7653 | ||
| EDTA | MSI | E9884 | ||
| Nitrocellulose | Sigma | 60443 | ||
| N-N Dimethyl Formamide | Extracted from Large New | D4254 | ||
| Rabbit skeletal myosin II | Zealand White Rabbits (7-8) | NA | ||
| MF30 antibody (9-10) | Developmental Studies | MF30 | ||
| MF20 antibody (6) | Hybridoma Bank | MF20 | ||
| Lab microscope | Boreal | WW57905M00 | ||
| Equatorial mount | Celestron | CG-5 | ||
| Digital video cam | Sony | XCDV60 | ||
| Caliper release | Cabelas | IA-415482 | ||
| Compression spring | Jones Spring Co. | 723 | ||
| Extension spring | Jones Spring Co. | 770 | ||
| ImageJ | NIH | NA | ||
| Fire-i drivers & application | Unibrain | 3.80 | ||
| Excel | Microsoft | NA |
References
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