Demonstrera användning av Novel gravitationskraften Spektrometer att stretcha och Mät Fibrer Proteiner
Summary
Detta är ett steg för steg guide som visar syfte, drift och representativa resultat från romanen gravitationskraften spektrometer.
Abstract
Studiet av makromolekylära struktur har blivit avgörande att klarlägga molekylära mekanismer och funktion. Det finns flera begränsade, men viktiga bioinstruments kan testa styrkan beroende av strukturella drag i proteiner. Skala har varit en begränsande parameter på hur exakt forskare kan blicka in i nanomechanical värld av molekyler, såsom nukleinsyror, enzymer och proteiner motor som utför livsuppehållande arbete. Atomkraftsmikroskopi (AFM) är väl anpassad för att bestämma infödda strukturer av fibrösa proteiner med ett avstånd resolution om paritet med elektronmikroskopi. Men i AFM kraft studier krafterna är vanligtvis mycket högre än en enda molekyl kan uppleva 1, 2. Optisk fällor (OT) är väldigt bra på att bestämma det relativa avståndet mellan fångade pärlor och de kan ge mycket små styrkor 3. Däremot ger de inte exakt absoluta längden av molekyler under studien. Molekylär simuleringar ge stödjande information till sådana experiment, men är begränsade i förmågan att hantera samma stora molekylära storlekar, långa tidsramar, och övertyga vissa forskare i avsaknad av andra bevis 2, 4.
Gravitationskraften spektrometer (GFS) fyller en viktig nisch i den arsenal av en utredare genom att tillhandahålla en unik kombination av förmågor. Detta instrument kan generera krafter normalt med 98% eller bättre precision från femtonewton intervallet till nanonewton sortimentet. Avståndet Mätningarna är närvarande kan lösa det absolut molekylära längd ned till fem nanometer, och relativ pärla par sträckor separation med en precision som liknar en optisk fälla. Dessutom kan GFS avgöra stretching eller uncoiling där kraften är nära jämvikt eller ger ett graderat kraft att placera vid sidan mot varje uppmätt strukturella förändringar. Det är även möjligt att bestämma hur många aminosyror är inblandade i uncoiling händelser under fysiologiska kraft belastning 2. Till skillnad från andra metoder där det finns omfattande kraft kalibrering som måste föregå varje analys kräver GFS ingen sådan kraft kalibrering 5. Genom att komplettera styrkan av andra metoder, kommer GFS överbrygga luckor i förståelsen nanomekanik av vitala proteiner och andra makromolekyler.
Protocol
Discussion
När du konverterar en film till ett digitalt thresholded representation, är det avgörande för thresholded bilden för att bibehålla samma område i varje bildruta. Eftersom pärlor i en pärla par rör sig oberoende av varandra, kan varje förändring i thresholded områden också orsaka de relativa avstånden mellan centroids av pärlor att driva och införa väsentliga fel. Styra tröskeln området minskat fel fem gånger i fjärran mätningarna från 26 nm ner till 5 nm. Det är också viktigt att få en exakt r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta material är baserat på arbete som stöds av National Science Foundation i Grant nr 0.842.736.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 3-Aminopropyltriethoxysilane | Poly Sciences | 919-30-2 | ||
| Acetone | Fisher Scientific | A18P-4 | ||
| Pyridine | Sigma Aldrich | 110-86-1 | ||
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | G7776 | ||
| Glycine | Research Organics | BP381-1 | ||
| Tris | Sigma | 9682T | ||
| Sodium azide | Amresco | 71289 | ||
| BSA | Sigma Aldrich | AMR-0332-100G | ||
| NaCl | Sigma | S7653 | ||
| EDTA | MSI | E9884 | ||
| Nitrocellulose | Sigma | 60443 | ||
| N-N Dimethyl Formamide | Extracted from Large New | D4254 | ||
| Rabbit skeletal myosin II | Zealand White Rabbits (7-8) | NA | ||
| MF30 antibody (9-10) | Developmental Studies | MF30 | ||
| MF20 antibody (6) | Hybridoma Bank | MF20 | ||
| Lab microscope | Boreal | WW57905M00 | ||
| Equatorial mount | Celestron | CG-5 | ||
| Digital video cam | Sony | XCDV60 | ||
| Caliper release | Cabelas | IA-415482 | ||
| Compression spring | Jones Spring Co. | 723 | ||
| Extension spring | Jones Spring Co. | 770 | ||
| ImageJ | NIH | NA | ||
| Fire-i drivers & application | Unibrain | 3.80 | ||
| Excel | Microsoft | NA |
References
- Schwaiger, I., Sattler, C., Hostetter, D. R., Rief, M. The myosin coiled-coil is a truly elastic protein structure. Nat. Mater. 1, 232-235 (2002).
- Root, D. D., Yadavalli, V. M., Forbes, J. G., Wang, K. Coiled-coil nanomechanics and uncoiling and unfolding of the superhelix and alpha-helices of myosin. Biophysical Journal. 90, 2852-2866 (2006).
- Nishizaka, T., Miyata, H., Yoshikawa, H., Ishiwata, S., Kinosita, K. Unbinding force of a single motor molecule of muscle measured using optical tweezers. Nature. 377, 251-254 (1995).
- Gawalapu, R. K., Root, D. D. Fluorescence labeling and computational analysis of the strut of myosin’s 50 kDa cleft. Arch. Biochem. Biophys. 456, 102-111 (2006).
- Kellermayer, M. S. Z. Visualizing and manipulating individual protein. Molecules Physiol. Meas. 26, R119-R153 (2005).
- Shimizu, T., Dennis, J. E., Masaki, T., Fischman, D. A. Axial arrangement of the myosin rod in vertebrate thick filaments: immunoelectron microscopy with a monoclonal antibody to light meromyosin. J. Cell Biol. 101, 1115-1123 (1985).
- Godfrey, J. E., Harrington, W. F. Self-association in the myosin system at high ionic strength. I. Sensitivity of the interaction to pH and ionic environment. Biochemistry. 9, 886-893 (1970).
- Root, D. D., Stewart, S., Xu, J. Dynamic docking of myosin and actin observed with resonance energy transfer. Biochemistry. 41, 1786-1794 (2002).
- Xu, J., Root, D. D. Conformational Selection during Weak Binding at the Actin and Myosin Interface. Biophys. J. 79, 1498-1510 (2000).
- Sattin, B. D., Pelling, A. E., Goh, M. C. DNA base pair resolution by single molecule force spectroscopy. Nucleic Acids Res. 32, 4876-4883 (2004).
