Summary
Wir beschreiben eine einfache Immunoassay auf die Produktion von pro-inflammatorischen Zytokinen wie IL-1 beta Produktion, bei Patienten mit autoinflammatorisches Phänotypen zu messen. Durch Aktivierung von Zellen in Vollblut-Kulturen mit pathogen-associated molecular patterns, speziell mit Lipopolysaccharid kann Zytokinsekretion bequem in Vollblut Überstände ausgewertet werden.
Abstract
Entzündliche Prozesse, die sich aus der Sekretion von löslichen Mediatoren von Immunzellen, die verschiedenen Erscheinungsformen in der Haut, Gelenke und andere Gewebe sowie veränderte Zytokin-Homöostase führen. Das angeborene Immunsystem spielt eine entscheidende Rolle bei der Anerkennung Krankheitserreger und andere endogene Gefahr Reize. Einer der wichtigsten Zytokine durch angeborene Immunsystem Zellen freigesetzt wird Interleukin (IL) -1. Daher verwenden wir eine Vollblut-Stimulation Assays, um die Sekretion von inflammatorischen Zytokinen zu messen und gezielt der pro-inflammatorischen Zytokine IL-1β 1, 2, 3.
Patienten mit genetischen Störungen des angeborenen Immunsystems verursacht autoinflammatorisches Syndrome zeigen eine übertriebene Version von reifen IL-1β nach Stimulation mit LPS allein. Um das angeborene Immunsystem Komponente der Patienten, die mit entzündlichen-assoziierten Erkrankungen derzeit zu bewerten, verwenden wir einen spezifischen Immunoassay für die zelluläre Immunantwort zu pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), wie die gram-negative bakterielle Endotoxine zu erkennen, Lipopolysaccharid (LPS ). Diese PAMPs werden durch Erreger recognition receptors (PRR), die auf die Zellen des angeborenen Immunsystems 4, 5, 6, 7 gefunden werden anerkannt. Eine primäre Signal, LPS, in Verbindung mit einem sekundären Signal, ATP, ist notwendig für die Aktivierung der Inflammasom, ein Multiproteinkomplex, dass Pro-IL-1β Prozesse ihrer reifen, bioaktive Form 4, 5, 6, 8, 9, 10.
Die Vollblut-Assay erfordert nur minimale Probe Manipulation Zytokin-Produktion zu bewerten, wenn andere Methoden, die arbeitsintensive Isolierung und Kultivierung von spezifischen Zellpopulationen erfordern verglichen. Diese Methode unterscheidet sich von anderen Vollblut Stimulation Assays, sondern als Verdünnen von Proben mit einem Verhältnis von RPMI-Medium, führen wir eine weiße Blutzelle direkt count aus verdünntem Vollblut und damit zu stimulieren eine bekannte Anzahl von weißen Blutzellen in Kultur 2. Die Ergebnisse dieser besonderen Vollblut-Assay zeigen eine neuartige Technik nützlich bei der Aufklärung Patientengruppen präsentiert mit autoinflammatorisches Pathophysiologien.
Protocol
1. Sammlung von Vollblut
- Besorgen Sie sich ein Minimum von 10 ml peripheres Blut von Betroffenen sowie Alter und Geschlecht gegenübergestellten gesunden Kontrollgruppe. Das venöse Blut muss in Natrium-Heparin enthaltende Vacutainer Blutentnahmeröhrchen gesammelt werden, anstatt die andere Gerinnungshemmer wie EDTA, und umgekehrt mehrmals, um die ordnungsgemäße Mischung mit dem Natrium-Heparin zu gewährleisten. Beachten Sie, dass 10 mL der minimalen Volumen von Vollblut für die Beschichtung Proben in zweifacher Ausfertigung für diesen speziellen Test erforderlich ist.
- Die Proben sollten so bald wie möglich nach der Entnahme für die besten Ergebnisse verarbeitet werden. Allerdings kann Heparinblut bei Raumtemperatur unter schlechten Lichtverhältnissen gelagert werden bis zu 24 Stunden bis zu seiner Verarbeitung (2) sein.
2. Vorbereitung von Whole Blood
- Centrifuge alle Blutproben bei 3000 Umdrehungen pro Minute (mit Bremse ausgeschaltet) für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Ohne Beeinträchtigung der Buffy-Coat, kann das Plasma von der Spitze gesammelt und gespeichert werden für andere experimentelle Zwecke. Plasmaproben können vorübergehend bei -20 ° C oder -80 ° C für die langfristige Lagerung gespeichert
- Sobald Plasma gesammelt wird, waschen Proben durch Resuspendieren der roten Blutkörperchen (RBC) Pellet-und Buffy-Coat mit serumfreiem (unvollständige) RPMI 1640 Medium (bei Raumtemperatur). Gently Pipette die Mischung in der Sammlung Rohre und Transfer zu einem 50 mL konischen Rohr.
- Volumen bis 50 ml mit unvollständigen RPMI 1640 Kulturmedien und vorsichtig umdrehen die Rohre zu einem homogenen Gemisch zu erzeugen. Centrifuge Proben bei 3000 rpm (mit Bremse ausgeschaltet) für 10 Minuten. Sicherstellen, dass es eine klare Trennung, absaugen der Überstand, darauf achten, daß der Buffy-Coat stören. Wiederholen Sie diesen Vorgang 2-4 mal, um sicherzustellen, dass alle Verunreinigungen und gebundenen Zytokine sind, bevor die Stimulation entfernt.
- Nach der letzten Waschung, resuspendieren RBC Pellet-und Buffy-Coat, so dass das Gesamtvolumen 20 ml (für 10 ml Vollblut zunächst gezeichnet) mit unvollständigen RPMI 1640 Medium ist. Das Gesamtvolumen kann bezogen auf das Volumen des Blutes zunächst gezeichnet angepasst werden.
- Mit dem Cellometer Vision, kann verdünnt das Blut, ohne Lyse Erythrozyten, indem Sie die Anzahl der weißen Blutkörperchen Option mit Acridinorange (AO) gezählt werden. Fügen Sie einen Teil verdünntes Blut mit einem Teil AO und Last 20 ul der 1:1-Mischung in einen Einweg-Zählkammer. Die Endkonzentration der AO nach Verdünnung sollte 1μg/mL.
- Passen Sie entsprechend mit unvollständigen RPMI 1640 Medium, um eine endgültige Zellkonzentration von 2,0 x 10 6 Zellen / ml.
3. Stimulation von Vollblut
- Der Test erfordert ein Minimum von vier Bedingungen (jeweils in doppelter Ausfertigung): unstimulierten, Zugabe von LPS allein die Zugabe von ATP allein, und schließlich LPS plus ATP addiert. 1 ml der vorbereiteten 2,0 x 10 6 Zellen / ml verdünntem Vollblut in die entsprechende Vertiefung einer 24-well Zellkulturschale.
- Die Stimulanzien sollten aufgelöst und bis auf Raumtemperatur gebracht, bevor die Stimulation Assays. Lyophilisierte LPS und ATP sollte nach den Anweisungen des Herstellers rekonstituiert werden. Nach der Zubereitung kann LPS und ATP weiter, um eine ordnungsgemäße Lager-Konzentration mit dem unvollständigen RPMI 1640-Medium verdünnt werden.
- Add LPS, die LPS nur so gut wie die LPS plus ATP auch so, dass die endgültige Arbeitskonzentration von LPS 1 pg / mL ist. Die gesamte Stimulation beträgt 3 Stunden. Allerdings ist Vollblut mit LPS für 2 Stunden und 40 Minuten stimuliert. Die Proben sollten in einem Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2 platziert werden.
- ATP ist in den verbleibenden 20 Minuten der 3 Stunden Stimulation Zeitraum aufgenommen. Add ATP um die ATP allein und die LPS-und ATP sowie Ort und Proben im Inkubator. Die letzte Arbeit Konzentration von ATP beträgt 2 mm.
- Nach dem 3 Stunden Inkubationszeit, sammeln Überstände durch Aliquotierung jede Probe in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und anschließend zentrifugiert Proben bei 10000 rpm für 2 Minuten bei Raumtemperatur. Die Überstände auf einen anderen Satz von 1,5 Mikrozentrifugenröhrchen.
- Die Proben können sofort getestet werden oder zwischengelagert bei -20 ° C oder -80 ° C für eine langfristige Lagerung.
4. Cytokinassay
- Proben, die eingefroren sind notwendig, um auf Raumtemperatur vor der Analyse Gleichgewicht zu bringen. Cytokine Konzentrationen für IL-1βcan anhand einer Vielzahl von Methoden. Wir nutzen die Bio-Plex Pro menschliche Zytokin x-plex-Test mit dem Bio-Plex 200-System, den Anweisungen des Herstellers. In diesem Protokoll sind wir speziell die Messung von IL-1β, jedoch nutzen wir diese Multiplex-Zytokin-Assays, um gleichzeitig zu messen mehrere Zytokine in einem Test mit dem Vorteil der Verwendung eines kleinen Probenvolumen.
5. Repräsentative Ergebnisse
Die Analyse der IL-1β Produktion bei erfolgreicher Stimulation mit LPS und ATP zeigt eine nichtse Antwort abhängig von der Anzahl der Zellen stimuliert. Wir haben festgestellt, dass 2,0 x 10 6 Zellen / ml ausreichend hoher Konzentration, um eine optimale und messbare Konzentration von IL-1β sowie anderer Zytokine (Abbildung 2) zu produzieren.
Vollblut-Assays sind nützlich bei der Untersuchung Patienten, die mit autoinflammatorisches Erscheinungsformen zu präsentieren. Diese Patienten können einen Defekt in der angeborenen Immunsystems, die durch eine Überproduktion von IL-1β (wenn im Vergleich zu Kontrollen) nach Stimulation mit LPS allein (Abb. 3) charakterisiert werden kann.
Abbildung 1. Representative Bild von AO Färbung für kernhaltigen weißen Blutkörperchen, um zur Zellkonzentration in verdünntem Vollblut-Proben zu bestimmen.
Abbildung 2. IL-1β Produktion in Vollblut Überstände von einem gesunden Spender nach Stimulation mit LPS zu erhöhen Zelle Konzentrationen gemessen. Die Proben wurden in dreifacher Ausfertigung analysiert.
Abbildung 3. Repräsentative Ergebnisse der IL-1β Sekretion im Vollblut Überstände von zwei gesunden Kontrollpersonen sowie zwei Patienten mit IL-1β-assoziierten autoinflammatorisches Manifestationen gemessen.
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Discussion
Die Vollblut-Assay beschrieben ist eine einfache Methode, die genauer imitiert physiologischen Bedingungen zu anderen Techniken, die Zell-Isolierung und umfangreiche Stichprobe Bearbeitung und Manipulation erfordern würde verglichen. Diese Methode nutzt die Cellometer Vision mit AO zum weißen Blutkörperchen im Vollblut zu zählen und daher bietet die Möglichkeit, präzise Standardisierung Proben auf Zell-Zahlen.
Es ist zu beachten, dass für diesen Test, Vollblut in Heparin-Natrium-Röhrchen gezogen werden sollten wie andere Antikoagulantien Calciumchelatoren sind bekannt und können somit Einfluss auf die Ergebnisse des Tests sein. Serum freie Medien sollten auch verwendet werden, da dieses Zytokin-Konzentrationen beeinträchtigen könnten. Auch wichtig ist die sofortige Bearbeitung der Proben einmal gewonnen. Während die beschriebene Methode nutzt LPS und ATP zu Vollblut anzuregen und Maßnahmen IL-1βconcentration, andere Krankheitserreger und Reize verwendet, um verschiedene Zytokin-und Chemokin-Antworten nach Stimulation gemessen werden kann, jedoch kann die Stimulation und die Bedingungen müssen entsprechend angepasst werden. Schließlich kann konstant Gefrier-Auftau-Zyklen beeinflussen Zytokin-Konzentrationen.
Der Nachweis von IL-1β Nutzung der Vollblut Stimulation beschriebene Assay stellt eine Alternative zu anderen Methoden und ist ein wirksames Immunoassay für Krankheiten mit entzündlichen-assoziierten Erkrankungen zu studieren.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch die Interne Research Program des National Institute of Arthritis and Bewegungsapparates und Hautkrankheiten der National Institutes of Health unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Heparin Blood Collection Tubes | BD Biosciences | 366480 | |
| RPMI 1640 Media | GIBCO, by Life Technologies | 21870-100 | |
| Acridine Orange | Invitrogen | A3568 | |
| Cellometer Vision | Nexcelom Bioscience | Contact company for instrument information | |
| Cellometer Cell Counting Chambers | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100 | |
| 24-well Tissue Culture Plate | Corning | 3524 | |
| Ultra Pure E. coli K12 LPS | Invitrogen | tlrl-eklps | |
| Adenosine 5´-tripohasphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Bio-plex 200 system | Bio-Rad | Contact company for instrument information | |
| Bio-Plex Pro human cytokine x-plex assay | Bio-Rad | x-plex assays are custom made according to specified cytokines of interest |
References
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