Summary
हम समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स के उत्पादन, आईएल -1 बीटा उत्पादन जैसे autoinflammatory phenotypes के साथ पेश रोगियों में, को मापने के लिए एक सरल immunoassay का वर्णन. रोगज़नक़ जुड़े lipopolysaccharide के साथ विशेष रूप से आणविक पैटर्न के साथ पूरे रक्त संस्कृतियों में कोशिकाओं को सक्रिय करके, cytokine स्राव सुविधा पूरे रक्त supernatants में मूल्यांकन किया जा सकता है.
Abstract
सूजन प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा घुलनशील मध्यस्थों के स्राव से उत्पन्न प्रक्रियाओं, त्वचा, जोड़ों और अन्य ऊतकों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बदल साइटोकाइन homeostasis में विभिन्न अभिव्यक्तियों के लिए नेतृत्व. सहज प्रतिरक्षा प्रणाली रोगज़नक़ों और अन्य अंतर्जात खतरे उत्तेजनाओं को पहचानने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. प्रमुख सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा जारी साइटोकिन्स के इंटरल्युकिन -1 (आईएल) है. इसलिए, हम एक पूरे रक्त उत्तेजना परख का उपयोग क्रम में भड़काऊ साइटोकिन्स के स्राव को मापने के लिए और विशेष रूप से समर्थक भड़काऊ cytokine 1 आईएल 1β, 2, 3.
सहज प्रतिरक्षा प्रणाली के autoinflammatory सिंड्रोम के कारण आनुवंशिक रोग के साथ मरीजों को परिपक्व LPS के साथ अकेले उत्तेजना पर आईएल 1β के एक अतिरंजित रिलीज दिखा. आदेश में जो भड़काऊ जुड़े विकृतियों के साथ उपस्थित रोगियों की सहज प्रतिरक्षा घटक का मूल्यांकन करने के लिए, हम एक विशिष्ट रोगज़नक़ जुड़े आणविक (PAMPs) ग्राम नकारात्मक बैक्टीरियल endotoxin जैसे पैटर्न, के लिए सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का पता लगाने immunoassay lipopolysaccharide (LPS का उपयोग ). ये PAMPs रोगज़नक़ मान्यता (PRRs) रिसेप्टर्स, जो सहज प्रतिरक्षा प्रणाली 4, 5, 6, 7 की कोशिकाओं पर पाया जाता है के द्वारा मान्यता प्राप्त हैं. एक प्राथमिक संकेत है, एक माध्यमिक संकेत, एटीपी, inflammasome के सक्रियण एक multiprotein जटिल है कि अपने परिपक्व, bioactive 4 फार्म, 5, 6, 8, 9 समर्थक आईएल 1β प्रक्रियाओं के लिए आवश्यक है के साथ संयोजन के रूप में LPS, 10.
पूरे रक्त परख न्यूनतम नमूना हेरफेर की आवश्यकता है cytokine उत्पादन का आकलन करने के लिए जब अन्य विधियों है कि श्रम गहन और विशिष्ट सेल आबादियों के अलगाव संवर्धन की आवश्यकता की तुलना में. इस विधि अन्य पूरे रक्त उत्तेजना assays से अलग है, RPMI मीडिया का एक अनुपात के साथ नमूने गिराए बजाय, हम एक सफेद रक्त कोशिका प्रदर्शन पतला पूरे रक्त से सीधे गिनती और इसलिए, 2 संस्कृति में एक सफेद रक्त कोशिकाओं के ज्ञात संख्या को प्रोत्साहित. यह विशेष रूप से पूरे रक्त परख के परिणाम एक उपन्यास autoinflammatory pathophysiologies के साथ पेश रोगी साथियों elucidating में उपयोगी तकनीक का प्रदर्शन.
Protocol
1. पूरे रक्त का संग्रह
- प्रभावित व्यक्तियों के रूप में अच्छी तरह के रूप में आयु और लिंग के मिलान स्वस्थ नियंत्रण से परिधीय रक्त की 10 एमएल की एक न्यूनतम प्राप्त करते हैं. शिरापरक रक्त में सोडियम हेपरिन vacutainer रक्त संग्रह ट्यूबों में एकत्र होना चाहिए EDTA, और उल्टे कई बार के रूप में अन्य anticoagulants का उपयोग करने के लिए सोडियम हेपरिन के साथ उचित मिश्रण सुनिश्चित के बजाय. ध्यान दें कि 10 एमएल पूरे खून की इस विशेष परख के लिए दो प्रतियों में चढ़ाना नमूने के लिए आवश्यक न्यूनतम मात्रा है.
- नमूने सर्वोत्तम परिणामों के लिए संग्रह के बाद जितनी जल्दी हो सके संसाधित चाहिए. हालांकि, heparinized रक्त मंद प्रकाश व्यवस्था के तहत कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है के लिए 24 घंटे तक जब तक (2) संसाधित किया जा करने के लिए तैयार है.
2. पूरे रक्त की तैयारी
- कमरे के तापमान पर दस मिनट के लिए 3000 rpm (के साथ ब्रेक बंद कर दिया) पर सभी रक्त के नमूनों अपकेंद्रित्र. Buffy कोट परेशान बिना, प्लाज्मा ऊपर से एकत्र किया जा सकता है और अन्य प्रयोगात्मक प्रयोजनों के लिए संग्रहीत. प्लाज्मा के नमूने अस्थायी रूप से ° दीर्घकालिक भंडारण के लिए सी -20 डिग्री सेल्सियस या -80 में संग्रहीत किया जा सकता है
- एक बार प्लाज्मा एकत्र की है, सीरम (अधूरा) मुक्त RPMI 1640 मीडिया (परिवेश के तापमान पर) के साथ लाल रक्त सेल (आरबीसी) गोली और buffy कोट resuspending द्वारा नमूनों धो. धीरे संग्रह ट्यूबों में मिश्रण विंदुक और एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब के लिए स्थानांतरण.
- अधूरा RPMI 1640 संस्कृति मीडिया के साथ 50 एमएल और धीरे ट्यूबों पलटना एक समरूप मिश्रण बनाने के ऊपर वॉल्यूम. दस मिनट के लिए 3000 rpm (के साथ ब्रेक बंद कर दिया) नमूने अपकेंद्रित्र. यकीन है कि बनाना स्पष्ट विभाजन है, aspirate सतह पर तैरनेवाला, buffy कोट परेशान नहीं सावधान किया जा रहा है. इस प्रक्रिया को दोहराएँ 2-4 बार करने के लिए सुनिश्चित करें कि सभी contaminants और बाध्य साइटोकिन्स उत्तेजना के लिए पहले हटा रहे हैं.
- पिछले धोने के बाद, आरबीसी गोली और buffy कोट तो resuspend कि कुल मात्रा अधूरा RPMI 1640 मीडिया के साथ 20 एमएल (पूरे रक्त शुरू तैयार की 10 एमएल के लिए) है. शुरू में तैयार की खून की मात्रा के आधार पर कुल मात्रा समायोजित किया जा सकता है.
- Cellometer विजन का प्रयोग, खून पतला lysing लाल रक्त कोशिकाओं के बिना सफेद रक्त कोशिका गिनती acridine नारंगी (एओ) का उपयोग विकल्प चुनने के द्वारा गिना जा सकता है. एक हिस्सा एओ और लोड एक डिस्पोजेबल गिनती चेंबर में 1:1 मिश्रण के 20 μL के साथ एक हिस्सा पतला रक्त जोड़ें. ए ओ के कमजोर पड़ने के बाद अंतिम एकाग्रता 1μg/mL होना चाहिए.
- अधूरा RPMI 2.0 10 6 कोशिकाओं / एमएल एक्स के अंतिम सेल एकाग्रता के लिए 1640 मीडिया के साथ तदनुसार समायोजित करें .
3. पूरे रक्त की उत्तेजना
- परख चार (प्रत्येक दो प्रतियों में किया) स्थितियों की एक न्यूनतम आवश्यकता है: unstimulated, अकेले LPS के अलावा, एटीपी अकेले के अलावा, और अंत में LPS अधिक एटीपी एक साथ जोड़ा. 24 अच्छी तरह से एक ऊतक संस्कृति की थाली का उचित कुएँ में तैयार x 10 6 कोशिकाओं / एमएल पतला पूरे रक्त 2.0 के 1 एमएल जोड़ें.
- उत्तेजक और पुनर्गठन किया जाना चाहिए उत्तेजना परख शुरू होने से पहले कमरे के तापमान पर लाया. Lyophilized LPS और एटीपी निर्माता के निर्देशों के अनुसार पुनर्गठन किया जाना चाहिए. पुनर्गठन के बाद, LPS और एटीपी आगे एक उचित शेयर अधूरा RPMI 1640 मीडिया का उपयोग एकाग्रता के लिए पतला किया जा सकता है.
- LPS के लिए केवल के रूप में के रूप में अच्छी तरह से LPS अधिक एटीपी तक LPS अच्छी तरह से इतना है कि LPS के अंतिम कार्य एकाग्रता μg 1 / एमएल जोड़ें. कुल उत्तेजना समय तीन घंटे है. हालांकि, पूरे रक्त 2 घंटे और 40 मिनट के लिए LPS के साथ प्रेरित है. नमूने 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर एक इनक्यूबेटर में रखा जाना चाहिए.
- एटीपी 3 घंटे उत्तेजना की अवधि के शेष 20 मिनट के दौरान जोड़ा जाता है. एटीपी अकेले और LPS और एटीपी और इनक्यूबेटर में अच्छी तरह से जगह नमूने एटीपी जोड़ें. एटीपी के अंतिम कार्य एकाग्रता 2mm है.
- 3 घंटे ऊष्मायन अवधि के बाद, एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में प्रत्येक नमूना aliquoting और बाद में कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 10000 rpm पर नमूने centrifuging supernatants इकट्ठा. 1.5 microcentrifuge ट्यूबों का एक और सेट करने के लिए supernatants स्थानांतरण.
- नमूने तुरंत हो सकता है या assayed कर सकते हैं संग्रहीत अस्थायी रूप से -20 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस लंबी अवधि के भंडारण के लिए.
4. Cytokine परख
- नमूने जमे हुए हैं कि विश्लेषण से पहले कमरे के तापमान को संतुलित करने की जरूरत है. आईएल 1βcan के लिए cytokine सांद्रता एक किस्म के तरीकों का उपयोग कर मूल्यांकन किया. हम निर्माता के निर्देशों के अनुसार जैव plex प्रो मानव जैव Plex 200 प्रणाली के साथ एक्स - plex परख साइटोकाइन का उपयोग. इस प्रोटोकॉल में हम विशेष रूप से आईएल 1β मापने हैं, तथापि, हम इस मल्टीप्लेक्स cytokine परख का उपयोग क्रम में एक साथ एक परख में एक छोटा सा नमूना मात्रा का उपयोग कर के लाभ के साथ एकाधिक साइटोकिन्स को मापने.
5. प्रतिनिधि परिणाम
आईएल 1β LPS और एटीपी के साथ सफल उत्तेजना पर उत्पादन के विश्लेषण से पता चलता है एक करनासे जा रहा है प्रेरित कोशिकाओं की संख्या पर निर्भर प्रतिक्रिया. हमने पाया है कि 2.0 10 6 कोशिकाओं एक्स / एमएल आईएल 1β एक इष्टतम और मध्यम श्रेणी एकाग्रता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अन्य साइटोकिन्स (चित्रा 2) के उत्पादन के लिए पर्याप्त एकाग्रता है.
पूरे रक्त assays रोगियों है कि autoinflammatory अभिव्यक्तियों के साथ वर्तमान अध्ययन में उपयोगी होते हैं. इन रोगियों को सहज प्रतिरक्षा प्रणाली है, जो आईएल 1β LPS अकेले (चित्रा 3) के साथ उत्तेजना पर overproduction (जब नियंत्रण की तुलना में में) द्वारा लक्षण वर्णन किया जा सकता है में एक दोष दिखा सकते हैं.
चित्रा 1 nucleated सफेद रक्त कोशिकाओं क्रम में पतला पूरे रक्त के नमूनों में सेल एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया के लिए ए ओ धुंधला के प्रतिनिधि छवि.
चित्रा 2. आईएल 1β उत्पादन उत्तेजना पर बढ़ती सेल सांद्रता में LPS के साथ एक स्वस्थ दाता से पूरे रक्त supernatants में मापा जाता है . नमूने तीन प्रतियों में assayed थे.
चित्रा 3 आईएल 1β दो सामान्य स्वस्थ के रूप में के रूप में अच्छी तरह से नियंत्रण दो आईएल 1β जुड़े autoinflammatory अभिव्यक्तियों के साथ पेश रोगियों से पूरे रक्त supernatants में मापा स्राव के प्रतिनिधि परिणाम है .
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Discussion
पूरे रक्त परख वर्णित एक सरल तरीका है कि और अधिक बारीकी से जब अन्य तकनीक है कि सेल अलगाव और व्यापक नमूना प्रसंस्करण और हेरफेर की आवश्यकता होगी की तुलना में शारीरिक स्थितियों mimics है. इस विधि ए ओ के साथ Cellometer विजन पूरे रक्त में सफेद रक्त कोशिकाओं की गिनती और इसलिए, एक तरीका प्रदान करता है के लिए सही सेल नंबर के आधार पर नमूने मानकीकरण का इस्तेमाल.
उल्लेखनीय यह है कि इस परख के लिए, पूरे रक्त सोडियम हेपरिन संग्रह ट्यूबों में तैयार किया जाना चाहिए है के रूप में अन्य anticoagulants कैल्शियम chelators जाना जाता है और इस तरह परख के परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं. सीरम स्वतंत्र मीडिया भी क्योंकि इस cytokine सांद्रता को प्रभावित कर सकता है किया जाना चाहिए. इसके अलावा एक बार प्राप्त नमूनों की तत्काल प्रसंस्करण महत्वपूर्ण है. जबकि वर्णित विधि LPS और एटीपी का उपयोग करता है पूरे रक्त को उत्तेजित और आईएल 1βconcentration, अन्य रोगज़नक़ों और stimuli करने के लिए विभिन्न और उत्तेजना पर साइटोकाइन केमोकाइन प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है उपाय, तथापि, उत्तेजना बार और शर्तों के अनुसार समायोजित किया जा आवश्यकता हो सकती है. अंत में, लगातार फ्रीज पिघलना चक्र साइटोकाइन सांद्रता को प्रभावित कर सकता है.
पूरे रक्त उत्तेजना परख वर्णित का उपयोग आईएल 1β का पता लगाने के अन्य तरीकों के लिए एक विकल्प प्रदान करता है और भड़काऊ जुड़े विकृतियों के साथ बीमारियों का अध्ययन करने के लिए एक प्रभावी immunoassay है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस शोध गठिया और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के के Musculoskeletal और त्वचा रोग के राष्ट्रीय संस्थान के अंदर का रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Heparin Blood Collection Tubes | BD Biosciences | 366480 | |
| RPMI 1640 Media | GIBCO, by Life Technologies | 21870-100 | |
| Acridine Orange | Invitrogen | A3568 | |
| Cellometer Vision | Nexcelom Bioscience | Contact company for instrument information | |
| Cellometer Cell Counting Chambers | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100 | |
| 24-well Tissue Culture Plate | Corning | 3524 | |
| Ultra Pure E. coli K12 LPS | Invitrogen | tlrl-eklps | |
| Adenosine 5´-tripohasphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Bio-plex 200 system | Bio-Rad | Contact company for instrument information | |
| Bio-Plex Pro human cytokine x-plex assay | Bio-Rad | x-plex assays are custom made according to specified cytokines of interest |
References
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