Summary
Nós descrevemos um imunoensaio simples para medir a produção de citocinas pró-inflamatórias, como IL-1 beta de produção, em pacientes com fenótipos Autoinflamatórias. Pela ativação de células em culturas de sangue total com patógeno-padrões moleculares associados, especificamente com lipopolissacarídeo, a secreção de citocinas podem ser convenientemente avaliados em sobrenadantes de sangue total.
Abstract
Processos inflamatórios resultantes da secreção de mediadores solúveis por células do sistema imunológico, levar a várias manifestações na pele, articulações e outros tecidos, bem como a homeostase das citocinas alterada. O sistema imune inato desempenha um papel crucial no reconhecimento de patógenos e outros estímulos endógenos perigo. Uma das principais citocinas liberado por células do sistema imunológico inato é Interleucina (IL) -1. Portanto, nós utilizamos um ensaio de estimulação todo sangue para medir a secreção de citocinas inflamatórias e especificamente da citocinas pró-inflamatórias IL-1β 1, 2, 3.
Pacientes com disfunções genéticas do sistema imune inato causando síndromes Autoinflamatórias mostram uma liberação exagerada de IL 1β madura-upon estimulação com LPS sozinho. Para avaliar o componente imunológico inato de pacientes que apresentam patologias inflamatórias associadas, usamos um imunoensaio específico para detectar as respostas imunes celulares ao patógeno-padrões moleculares associados (PAMPs), tais como a endotoxina bacteriana gram-negativa, o lipopolissacarídeo (LPS ). Estes PAMPs são reconhecidos por receptores de reconhecimento de patógenos (PRRs), que são encontrados nas células do sistema imune inato 4, 5, 6, 7. Um sinal primário, LPS, em conjunto com um sinal secundário, ATP, é necessária para a ativação do inflammasome, um complexo multiprotein que os processos pró-IL-1β à sua forma, maduro bioativos 4, 5, 6, 8, 9, 10.
O ensaio de sangue total requer a manipulação de amostra mínima para avaliar a produção de citocinas, quando comparado a outros métodos que exigem o isolamento trabalho intensivo e cultura de populações de células específicas. Este método difere de outros ensaios de estimulação de sangue total, ao invés de diluir as amostras com uma proporção de RPMI mídia, realizamos uma contagem de células brancas do sangue diretamente do sangue total diluído e, portanto, estimular um número conhecido de células brancas do sangue na cultura 2. Os resultados deste ensaio de sangue especial toda demonstrar uma nova técnica útil na elucidação coortes paciente apresentando fisiopatologias Autoinflamatórias.
Protocol
1. Recolha de Sangue Total
- Obter um mínimo de 10 mL de sangue periférico de indivíduos afectados, bem como idade e sexo pareados controles saudáveis. Sangue venoso deve ser coletado em heparina sódica tubos vacutainer de coleta de sangue, ao invés de usar outros anticoagulantes, como EDTA, e invertido várias vezes para garantir a mistura adequada com a heparina sódica. Note-se que 10 mL é o volume mínimo de sangue necessário para amostras de revestimento em duplicado para este ensaio particular.
- As amostras devem ser processadas o mais rapidamente possível após a coleta para obter melhores resultados. No entanto, o sangue heparinizado pode ser armazenado em temperatura ambiente sob iluminação fraca por até 24 horas até que esteja pronto para ser processado (2).
2. Preparação de sangue total
- Centrífuga todas as amostras de sangue a 3.000 rpm (com freio desligado) por dez minutos em temperatura ambiente. Sem perturbar o buffy coat, o plasma pode ser recolhida a partir do topo e armazenados para outros fins experimentais. As amostras de plasma podem ser temporariamente armazenados a -20 ° C ou -80 ° C para o armazenamento de longo prazo
- Uma vez que plasma é coletado, lave amostras de ressuspender a célula vermelha do sangue (RBC) e pellet buffy coat com soro livre (incompleta) RPMI 1640 media (à temperatura ambiente). Pipeta suavemente a mistura nos tubos de coleta e transferência para um tubo cônico de 50 mL.
- Volume até 50 mL com incompleta RPMI 1640 meios de cultura e inverter cuidadosamente os tubos para criar uma mistura homogénea. Centrifugar as amostras a 3000 rpm (com freio desligado) por dez minutos. Certificando-se que há uma separação clara, aspirar o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar a buffy coat. Repita este procedimento 2-4 vezes para garantir que todos os contaminantes e citocinas vinculados são removidos antes da estimulação.
- Após a última lavagem, ressuspender o sedimento RBC e buffy coat de modo que o volume total é de 20 mL (para 10 mL de sangue total inicialmente sorteado) com incompleta RPMI 1640 mídia. O volume total pode ser ajustado com base no volume de sangue inicialmente sorteado.
- Usando a Visão Cellometer, o sangue diluído pode ser contado sem hemácias lise escolhendo a opção de leucócitos contagem de células usando laranja de acridina (AO). Adicione uma parte de sangue diluída com um AO parte e carga de 20 mL da mistura 1:1 em uma câmara de contagem descartáveis. A concentração final de AO após a diluição deve ser 1μg/mL.
- Ajustar de acordo com incompleta RPMI 1640 mídia para uma concentração celular final de 2,0 x 10 6 células / mL.
3. Estimulação do sangue total
- O ensaio requer um mínimo de quatro condições (cada feito em duplicado): não estimuladas, a adição de LPS sozinho, a adição de ATP por si só, e, finalmente, LPS, mais ATP somados. Adicionar 1 mL do preparado 2,0 x 10 6 células / mL de sangue diluído inteira dentro do poço apropriado de uma placa de cultura de 24 poços de tecido.
- Os estimulantes deve ser reconstituído e trouxe até à temperatura ambiente antes de iniciar o ensaio de estimulação. Liofilizado LPS e ATP deve ser reconstituído de acordo com as instruções do fabricante. Após a reconstituição, LPS e ATP pode ser diluída a uma concentração de estoque adequado usando incompleta RPMI 1640 mídia.
- Adicionar ao LPS LPS só, bem como para a LPS, mais ATP bem para que a concentração final de trabalho de LPS é de 1 mg / mL. O tempo de estimulação total é de 3 horas. No entanto, o sangue total é estimulado com LPS por 2 horas e 40 minutos. As amostras devem ser colocados em uma incubadora a 37 ° C e 5% CO 2.
- ATP é adicionado durante os restantes 20 minutos do período de estimulação de 3 horas. Adicionar ao ATP ATP por si só e os LPS e ATP bem e amostras lugar na incubadora. A concentração final de trabalho de ATP é 2mM.
- Após o período de incubação de 3 horas, recolher sobrenadantes de alíquotas de cada amostra num tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e, posteriormente, centrifugar amostras de 10000 rpm por 2 minutos em temperatura ambiente. Transferir o sobrenadante para outro conjunto de tubos de 1,5 microcentrífuga.
- As amostras podem ser analisadas imediatamente ou armazenados temporariamente a -20 ° C ou -80 ° C para armazenamento de longo prazo.
4. Ensaio de citocinas
- Amostras que são congelados necessidade de atingir a temperatura ambiente antes da análise. Concentrações das citocinas IL-1βcan para ser avaliado usando uma variedade de métodos. Nós utilizamos o Bio-plex citocina Pro humana x-plex ensaio com o Bio-Plex 200 sistema, por instruções do fabricante. Neste protocolo que são especificamente medição IL-1β, no entanto, nós utilizamos neste ensaio multiplex de citocinas, a fim de medir simultaneamente múltiplas citocinas em um ensaio com a vantagem de usar um volume de amostra pequena.
5. Resultados representante
Análise de IL-1β produção com a estimulação de sucesso com LPS e ATP mostra um fazersi a resposta depende do número de células sendo estimulada. Descobrimos que 2,0 x 10 6 células / mL é uma concentração suficiente para produzir uma concentração ótima e mensurável de IL-1β, assim como outras citocinas (Figura 2).
Doseamentos de sangue total são úteis no estudo de pacientes que se apresentam com manifestações Autoinflamatórias. Esses pacientes podem apresentar um defeito no sistema imune inato, que pode ser caracterizada pela superprodução de IL-1β (quando comparados aos controles) após estimulação com LPS isoladamente (Figura 3).
Figura 1. Image Representante do AO coloração para nucleadas células brancas do sangue utilizado para determinar a concentração de células em amostras de sangue total diluído.
Figura 2. Produção de IL-1β medido em sobrenadantes de sangue total de um doador saudável com a estimulação com LPS em concentrações crescentes de células. As amostras foram analisadas em triplicata.
Figura 3. Resultados Representante da IL-1β secreção medido em sobrenadantes de sangue total a partir de dois saudáveis controles normais, assim como duas pacientes com IL-1β associada manifestações Autoinflamatórias.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O ensaio de sangue total descrito é um método simples que reproduz com mais exatidão condições fisiológicas quando comparada a outras técnicas que exigem isolamento de células e processamento das amostras extensas e manipulação. Este método utiliza a Visão Cellometer com AO a contagem de células brancas do sangue em sangue total e, portanto, fornece uma maneira de padronizar as amostras com precisão com base em números de celular.
É de notar que, para este ensaio, o sangue total deve ser elaborado em tubos de sódio coleção heparina como anticoagulantes são conhecidos outros quelantes de cálcio e pode, portanto, afetar os resultados do ensaio. Soro de mídia livre também deve ser usado porque isso pode afectar as concentrações de citocinas. Também crucial é o processamento imediato das amostras, uma vez obtida. Enquanto o método descrito utiliza, LPS e ATP para estimular sangue total e as medidas de IL-1βconcentration, outros patógenos e estímulos pode ser usado para medir de citocinas e quimiocinas respostas com a estimulação, no entanto, os tempos de estímulo e condições podem precisar de ser ajustados em conformidade. Finalmente, constantes ciclos de congelamento e descongelamento podem afetar as concentrações de citocinas.
A detecção de IL-1β, utilizando o teste de estimulação de sangue total descrito fornece uma alternativa para outros métodos e é um imunoensaio eficaz para estudar doenças inflamatórias associadas com patologias.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa Intramural do Instituto Nacional de Artrite e Doenças músculo-esqueléticas e da pele do National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Heparin Blood Collection Tubes | BD Biosciences | 366480 | |
| RPMI 1640 Media | GIBCO, by Life Technologies | 21870-100 | |
| Acridine Orange | Invitrogen | A3568 | |
| Cellometer Vision | Nexcelom Bioscience | Contact company for instrument information | |
| Cellometer Cell Counting Chambers | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100 | |
| 24-well Tissue Culture Plate | Corning | 3524 | |
| Ultra Pure E. coli K12 LPS | Invitrogen | tlrl-eklps | |
| Adenosine 5´-tripohasphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Bio-plex 200 system | Bio-Rad | Contact company for instrument information | |
| Bio-Plex Pro human cytokine x-plex assay | Bio-Rad | x-plex assays are custom made according to specified cytokines of interest |
References
- Martinon, F., Mayor, A., Tschopp, J. The inflammasomes: guardians of the body. Annu Rev Immunol. 27, 229-265 (2009).
- Thurm, C. W., Halsey, J. F. Measurement of cytokine production using whole blood. Curr Protoc Immunol. 66, 7-18 Forthcoming.
- Mariathasan, S. Cryopyrin activates the inflammasome in response to toxins and ATP. Nature. 440, 228-232 (2006).
- Gabay, C., Lamacchia, C., Palmer, G. IL-1 pathways in inflammation and human diseases. Nat Rev Rheumatol. 4, 232-241 (2010).
- Franchi, L., Elgenbrod, T., Muñoz-Planillo, R., Nuñez, G. The inflammasome: a caspase-1-activation platform that regulates immune responses and disease pathogenesis. Nat Immunol. 3, 241-247 (2009).
- Sims, J. E., Smith, D. E. The IL-1 family: regulators of immunity. Nat Rev Immunol. 2, 89-102 (2010).
- Haug, R., Joø, G. B., Westvik, A. B., Kierulf, P. Chemokine production and pattern recognition receptor (PRR) expression in whole blood stimulated with pathogen-associated molecular patterns (PAMPs. Cytokine. 32, 304-315 (2005).
- Netea, M. G. Differential requirement for the activation of the inflammasome for processing and release of IL-1bin monocytes and macrophages. Blood. 113, 2324-2335 (2009).
- Latz, E. The inflammasomes: mechanisms of activation and function. Curr Opin Immnol. 22, 28-33 (2010).
- Masters, S. L., Simon, A., Aksentijevich, I., Kastner, D. L. Horror autoinflammaticus: the molecular pathophysiology of autoinflammtory disease. Annu Rev Immunol. 27, 621-668 (2009).
