Summary
אנו מתארים immunoassay פשוט למדוד את הייצור של ציטוקינים דלקתיים הפרו, כגון ייצור IL-1 בטא, בחולים עם הצגת פנוטיפים autoinflammatory. על ידי הפעלת התאים בתרביות דם שלם עם הפתוגן הקשורים דפוסי מולקולרית, במיוחד עם lipopolysaccharide, הפרשת ציטוקינים ניתן להעריך בנוחות supernatants הדם כולו.
Abstract
תהליכים דלקתיים הנובעים הפרשה של מתווכים מסיסים על ידי תאים חיסוניים, להוביל ביטוייה השונים בעור, במפרקים וברקמות אחרות, כמו גם הומאוסטזיס ציטוקינים משתנה. מערכת החיסון המולדת ממלא תפקיד מכריע בזיהוי פתוגנים אחרים גירויים סכנה אנדוגני. אחד הציטוקינים העיקריים שפורסמו על ידי תאים חיסוניים מולדים הוא אינטרלויקין (IL) -1. לכן, אנו מנצלים assay כל גירוי דם כדי למדוד את הפרשת ציטוקינים דלקתיים, ובמיוחד של הפרו דלקתי ציטוקינים IL-1β 1, 2, 3.
חולים עם תפקוד גנטיות של מערכת החיסון המולדת גרימת תסמונות autoinflammatory להראות שחרור מוגזם של בוגרת IL-1β על גירוי עם LPS לבד. כדי להעריך את מרכיב החיסון המולדת של חולים עם דלקת להציג הקשורים פתולוגיות, אנו משתמשים immunoassay ספציפיים כדי לזהות התגובה החיסונית התאית הפתוגן הקשורים דפוסים מולקולריים (PAMPs), כגון רעלן פנימי גרם שליליים של החיידק, lipopolysaccharide (LPS ). PAMPs אלה מוכרים על ידי קולטנים זיהוי הפתוגן (PRRs), הנמצאים על תאים של מערכת החיסון המולדת 4, 5, 6, 7. האות הראשוני, LPS, בשיתוף עם האות המשני, ה-ATP, הוא הכרחי עבור הפעלת inflammasome, מורכבת multiprotein כי תהליכים תומכי IL-1β כדי ליצור בוגרת, ביו שלה 4, 5, 6, 8, 9, 10.
Assay דם שלם דורש מניפולציה מדגם מינימלי כדי להעריך ייצור ציטוקינים בהשוואה לשיטות אחרות הדורשות בידוד culturing עבודה אינטנסיבית של אוכלוסיות תאים ספציפיים. שיטה זו שונה מן האחרים מבחני גירוי כולו דם, ולא דילול דגימות עם יחס של RPMI התקשורת, אנו מבצעים תא דם לבן לספור ישירות מן הדם כולו מדולל ולכן, לעורר מספר ידוע של כדוריות הדם הלבנות בתרבות 2. תוצאות assay דם בפרט הזה להפגין טכניקה חדשנית שימושי הבהרת המחזורים המטופל עם הצגת pathophysiologies autoinflammatory.
Protocol
1. איסוף דם מלא
- השגת מינימום של 10 מ"ל של דם היקפיים מ אנשים מושפעים, כמו גם גיל ומין שולטת בריא מתאימים. דם ורידי יש לאסוף לתוך הפרין סודיום vacutainer צינורות דם אוסף, ולא באמצעות תרופות נגד קרישת דם אחרים כמו EDTA, וכמה פעמים הפוכה על מנת להבטיח תערובת נכונה עם הפרין סודיום. שים לב, 10 מ"ל הוא נפח מינימלי של דם כל הנדרש דגימות ציפוי בשני עותקים עבור assay המסוים הזה.
- דוגמאות אמורה להתבצע מוקדם ככל האפשר לאחר איסוף התוצאות הטובות ביותר. עם זאת, דם heparinized ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר תחת תאורה עמומה של עד 24 שעות עד מוכן להיות מעובד (2).
2. הכנה של דם מלא
- צנטריפוגה כל דגימות דם ב 3000 סל"ד (עם בלם מבוטלת) במשך עשר דקות בטמפרטורת החדר. מבלי להפריע את המעיל באפי, הפלזמה ניתן לאסוף מראש ומאוחסנים לצורך ניסויים אחרים. דגימות פלזמה יכול להיות מאוחסן באופן זמני ° C עבור אחסון לטווח ארוך ב -20 ° C או -80
- לאחר פלזמה נאסף, לשטוף דגימות ידי resuspending תא הדם האדומים (RBC) גלולה ואת המעיל באפי עם סרום חופשי (חלקית) RPMI 1640 מדיה (בטמפרטורת הסביבה). פיפטה בעדינות את התערובת צינורות איסוף והעברת צינור חרוטי 50 מ"ל.
- נפח של עד 50 מ"ל עם שלם RPMI 1640 בתקשורת תרבות בעדינות להפוך את הצינורות כדי ליצור תערובת הומוגנית. צנטריפוגה דגימות ב 3000 סל"ד (עם בלם מבוטלת) למשך עשר דקות. לוודא שיש הפרדה ברורה, לשאוב supernatant, נזהרת לא להפריע את המעיל באפי. חזור על נוהל זה 2-4 פעמים על מנת להבטיח כי כל המזהמים ואת ציטוקינים מחויב מוסרים לפני הגירוי.
- לאחר לשטוף האחרון, resuspend גלולה RBC ו באפי מעיל כך הנפח הכולל הוא 20 מ"ל (עבור 10 מ"ל של דם מלא נמשך בתחילה) עם שלם RPMI 1640 התקשורת. הנפח הכולל יכול להיות מותאם על בסיס נפח הדם נמשך בתחילה.
- באמצעות חזון Cellometer, דם מדולל ניתן לספור ללא RBCs lysing ידי בחירה דם לבנים ספירת אפשרות שימוש acridine כתום (AO). מוסיפים דם חלק מדולל AO חלק אחד ולטעון 20 μL מתערובת 01:01 החדרה הספירה הפנויה. הריכוז הסופי של AO לאחר דילול צריך להיות 1μg/mL.
- התאם בהתאם עם שלם RPMI 1640 מדיה ריכוז התא הסופי של 2.0 x 10 6 תאים / מ"ל.
3. גירוי של דם מלא
- Assay דורש מינימום של ארבעה תנאים (כל אחד נעשה בשני עותקים): unstimulated, תוספת של LPS לבד, תוספת של ה-ATP לבד, ולבסוף LPS ועוד הוסיף ATP ביחד. הוסף 1 מ"ל של 2.0 מוכן x 10 6 תאים / מ"ל דם מדולל שלם לתוך הבאר המתאים צלחת 24 גם בתרבית רקמה.
- ממריצים צריך להיות מחדש והביא עד לטמפרטורת החדר לפני תחילת assay גירוי. Lyophilized LPS ו-ATP צריך להיות מחדש על פי הוראות היצרן. בעקבות הכינון מחדש, LPS ו-ATP יכול להיות מדולל נוספת ריכוז המניה הנכונה באמצעות שלם RPMI 1640 התקשורת.
- הוסף LPS של LPS בלבד, כמו גם את LPS בתוספת ATP גם כך ריכוז העבודה הסופית של LPS הוא 1 מיקרוגרם / מ"ל. בפעם גירוי הכולל הוא 3 שעות. עם זאת, הדם הזה הוא מגורה עם LPS עבור 2 שעות ו 40 דקות. דוגמאות צריך להיות ממוקם באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO 2.
- ATP הוא הוסיף במהלך 20 הדקות הנותרות של תקופת 3 שעות גירוי. הוסף ל-ATP בלבד ATP ו LPS היטב ATP דגימות מקום חממה. ריכוז העבודה הסופית של ה-ATP הוא 2 מ"מ.
- לאחר תקופת דגירה 3 שעות, לאסוף supernatants ידי aliquoting כל מדגם לתוך צינור 1.5 microcentrifuge מ"ל ולאחר מכן centrifuging דגימות בסל"ד 10000 למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. מעבירים את supernatants להגדיר אחרת של 1.5 צינורות microcentrifuge.
- דוגמאות ניתן assayed מיד או מאוחסן באופן זמני ° C עבור אחסון לטווח ארוך ב -20 ° C או -80.
4. ציטוקין Assay
- דוגמאות כי הם קפואים צורך לאזן לטמפרטורת החדר לפני ניתוח. ריכוזים ציטוקין IL-1βcan להעריך באמצעות מגוון של שיטות. אנו מנצלים את ציטוקינים Bio-Plex האדם Pro x-Plex assay עם מערכת 200 Bio-Plex, לפי הוראות היצרן. בפרוטוקול זה אנו במיוחד למדידת IL-1β, עם זאת, אנו מנצלים את זה assay ציטוקינים זמנית כדי למדוד בו זמנית מספר רב של ציטוקינים assay אחד עם התועלת של השימוש נפח דגימה קטנה.
5. נציג תוצאות
ניתוח של ייצור IL-1β על גירוי מוצלח עם LPS ו-ATP מציגה לעשותse התגובה תלויה במספר התאים להיות מגורה. מצאנו כי 2.0 x 10 6 תאים / מ"ל ריכוז מספיק כדי לייצר ריכוז אופטימלי למדידה של IL-1β כמו גם ציטוקינים אחרים (איור 2).
מבחני דם שלמים שימושיים בלימוד חולים בהווה עם גילויי autoinflammatory. חולים אלה עשויים להראות פגם במערכת החיסון המולדת, אשר יכול להיות מאופיין על ידי ייצור יתר של IL-1β (כאשר בהשוואה לקבוצת הביקורת) על גירוי עם LPS לבד (איור 3).
באיור 1. הדימוי נציג מכתים AO עבור גרעיני בתאי הדם הלבנים השתמשו על מנת לקבוע ריכוז תא בדילול דגימות דם כולו.
2. איור IL-1β הייצור נמדד supernatants דם כל מתורם בריא על גירוי עם LPS בריכוזים הגדלת התא. דוגמאות היו assayed בשלושה עותקים.
איור 3. תוצאות נציג הפרשת IL-1β נמדד supernatants דם שלם שני פקדים נורמליים ובריאים, כמו גם שני חולים עם הצגת IL-1β הקשורים ביטויים autoinflammatory.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Assay דם כל המתואר היא שיטה פשוטה יותר מקרוב מחקה מצבים פיזיולוגיים לעומת טכניקות אחרות, כי ידרוש בידוד תא ועיבוד מניפולציה מדגם נרחב. שיטה זו מנצלת את חזון Cellometer עם AO לספור בתאי הדם הלבנים בדם כולו, ולכן מספק דרך במדויק לתקנן דגימות מבוסס על מספרים סלולריים.
יש לציין כי עבור assay זה, דם כל צריך להיגרר הפרין צינורות נתרן אוסף כמו נוגדי קרישה אחרים ידועים chelators סידן ולכן יכול להשפיע על תוצאות assay. תקשורת חופשית סרום צריך לשמש גם כי זה עלול להשפיע על ריכוזים ציטוקינים. חיוני גם הוא עיבוד מיידי של דגימות שהתקבלו בעבר. בעוד בשיטה המתוארת משתמש LPS ו-ATP כדי לעורר דם כל אמצעים IL-1βconcentration, פתוגנים אחרים גירויים ניתן להשתמש כדי למדוד ציטוקינים שונים ותגובות chemokine על גירוי, אולם פעמים גירוי והתנאים עשויים צריך להיות בהתאם. לבסוף, קבוע להקפיא להפשיר מחזורי עשוי להשפיע על ריכוזים ציטוקינים.
זיהוי של IL-1β ניצול דם כל גירוי assay תיאר מספק אלטרנטיבה לשיטות אחרות ומהווה immunoassay אפקטיבי ללמוד עם מחלות דלקתיות הקשורים פתולוגיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המחקר עירונית של המכון הלאומי של דלקת מפרקים ומחלות עור השלד והשרירים וכן של המכון הלאומי לבריאות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Heparin Blood Collection Tubes | BD Biosciences | 366480 | |
| RPMI 1640 Media | GIBCO, by Life Technologies | 21870-100 | |
| Acridine Orange | Invitrogen | A3568 | |
| Cellometer Vision | Nexcelom Bioscience | Contact company for instrument information | |
| Cellometer Cell Counting Chambers | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100 | |
| 24-well Tissue Culture Plate | Corning | 3524 | |
| Ultra Pure E. coli K12 LPS | Invitrogen | tlrl-eklps | |
| Adenosine 5´-tripohasphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Bio-plex 200 system | Bio-Rad | Contact company for instrument information | |
| Bio-Plex Pro human cytokine x-plex assay | Bio-Rad | x-plex assays are custom made according to specified cytokines of interest |
References
- Martinon, F., Mayor, A., Tschopp, J. The inflammasomes: guardians of the body. Annu Rev Immunol. 27, 229-265 (2009).
- Thurm, C. W., Halsey, J. F. Measurement of cytokine production using whole blood. Curr Protoc Immunol. 66, 7-18 Forthcoming.
- Mariathasan, S. Cryopyrin activates the inflammasome in response to toxins and ATP. Nature. 440, 228-232 (2006).
- Gabay, C., Lamacchia, C., Palmer, G. IL-1 pathways in inflammation and human diseases. Nat Rev Rheumatol. 4, 232-241 (2010).
- Franchi, L., Elgenbrod, T., Muñoz-Planillo, R., Nuñez, G. The inflammasome: a caspase-1-activation platform that regulates immune responses and disease pathogenesis. Nat Immunol. 3, 241-247 (2009).
- Sims, J. E., Smith, D. E. The IL-1 family: regulators of immunity. Nat Rev Immunol. 2, 89-102 (2010).
- Haug, R., Joø, G. B., Westvik, A. B., Kierulf, P. Chemokine production and pattern recognition receptor (PRR) expression in whole blood stimulated with pathogen-associated molecular patterns (PAMPs. Cytokine. 32, 304-315 (2005).
- Netea, M. G. Differential requirement for the activation of the inflammasome for processing and release of IL-1bin monocytes and macrophages. Blood. 113, 2324-2335 (2009).
- Latz, E. The inflammasomes: mechanisms of activation and function. Curr Opin Immnol. 22, 28-33 (2010).
- Masters, S. L., Simon, A., Aksentijevich, I., Kastner, D. L. Horror autoinflammaticus: the molecular pathophysiology of autoinflammtory disease. Annu Rev Immunol. 27, 621-668 (2009).
