Summary
我々は、自己炎症表現型を呈する患者では、このようなIL - 1βの産生などの炎症性サイトカインの産生を測定するための単純なイムノアッセイについて説明します。病原体関連分子パターンと全血培養では細胞を活性化することによって、特にリポ多糖で、サイトカインの分泌は、便利な全血上清で評価することができます。
Abstract
免疫細胞による可溶性メディエーターの分泌に起因する炎症プロセスは、皮膚、関節や他の組織と同様に変更されたサイトカインの恒常性の様々な症状につながる。自然免疫系は病原体や他の内因性危険性の刺激を認識する上で重要な役割を果たしている。自然免疫細胞から放出される主要なサイトカインの一つは、インターロイキン（IL）-1です。したがって、我々は、炎症性サイトカインの分泌を測定するために、特に炎症性サイトカインIL -1β1、2、3の全血の刺激アッセイを利用しています。
自己炎症症候群を引き起こす先天性免疫系の遺伝学的機能障害を有する患者は、単独でLPSで刺激した時に成熟IL -1βの誇張されたリリースを示します。炎症に関連した病態を呈する患者の自然免疫成分を評価するために、我々はそのようなグラム陰性細菌のエンドトキシン、リポ多糖（LPSなどの病原体関連分子パターン（PAMPs）、に細胞性免疫応答を検出する特異的免疫測定法を使用してください）。これらのPAMPsは、自然免疫系4、5、6、7の細胞で検出される病原体認識受容体（PRRS）、によって認識されます。二次信号、ATP、ソームの活性化、その成熟、生理活性型4、5、6、8、9にプロIL -1β処理することが多タンパク質複合体のために必要であると組み合わせて主信号、LPS、、 10。
全血アッセイは、特定の細胞集団の労働集約的な分離と培養を必要とする他の方法と比較すると、サイトカイン産生を評価するための最小限のサンプルの操作が必要です。このメソッドは、他の全血を刺激アッセイとは異なり、むしろRPMI培地の比率でサンプルを希釈するよりも、我々は、白血球の希釈全血から直接カウントし、そのため、文化2の白血球の数がわかっているを刺激行います。この特定の全血アッセイの結果は、自己炎症病態を呈する患者コホートの解明に有用な新規技術を実証する。
Protocol
1。全血のコレクション
- 影響を受ける個人だけでなく、年齢や性別健常対照の末梢血10mLのの最小値を取得します。静脈血は、ヘパリンナトリウムバキュテイナ採血管に集め、ではなく、ヘパリンナトリウムとの適切な混合を確実にするためにEDTAのような他の抗凝固剤、および反転数回使用する必要があります。 10mLのがこの特定のアッセイのために二重にメッキのサンプルに必要な全血の最小量であることに注意してください。
- サンプルは、最良の結果を得るために収集した後、できるだけ早く処理されるべきです。最大24時間（2）処理される準備が整うまでのためにしかし、ヘパリン加血液は、薄暗い照明の下、室温で保存することができます。
2。全血の調製
- 室温で10分間3000rpmで（ブレーキ付きオフ）ですべての血液サンプルを遠心してください。バフィコートを乱すことなく、プラズマは上部から採取することができると他の実験的な目的のために保存されます。血漿サンプルは、一時的に-20℃または-80℃で長期保管のために保存することができます。
- いったんプラズマが収集され、赤血球（RBC）無血清（不完全な）RPMI 1640培地（周囲温度で）でペレットとバフィコートを再懸濁することにより試料を洗浄する。ゆっくりとコレクションチューブに混合物をピペットで、50 mLコニカルチューブに移す。
- まで不完全RPMI 1640培地50 mLに、ゆっくりと均一な混合物を作成するためにチューブを反転させるボリューム。 10分のために3000回転（ブレーキ付きオフ）でサンプルを遠心分離します。バフィコートを乱さないように注意しながら、上清を吸引、明確に分離があることを確認して作る。この手順を全ての汚染物質と結合したサイトカインを刺激する前に除去されることを保証するために2-4回繰り返します。
- 最後の洗浄の後、総体積が不完全RPMI 1640培地で20 mLの（全血10mLのために最初に描画される）になるように、RBCペレットおよびバフィーコートを再懸濁します。総ボリュームはDISABLED採血の量に基づいて調整することができます。
- Cellometerビジョンを使用して、希釈した血液は、アクリジンオレンジ（AO）を使用して白血球数のオプションを選択することで、赤血球を溶解することなくカウントすることができます。一部のAOと一部希釈した血液を追加し、使い捨ての計数室に1:1の混合物20μLをロードする。希釈後のAOの最終濃度は、1μg/mlのはずです。
- 2.0 × 10 6細胞/ mlの最終細胞濃度に不完全なRPMI 1640培地で適宜調整してください。
3。全血の刺激
- アッセイは、4つの条件（重複で行われた各）の最小値が必要：無刺激、LPS単独で、ATP単独での加算の加算を、そして最終的にLPSを加えたATPは加算さ。 24ウェル組織培養プレートの適切なウェルに調製した2.0 × 10 6細胞/ mLの希釈全血1mLを追加します。
- 覚せい剤は、刺激アッセイを開始する前に再構成し、室温に立ち上げることが必要。凍結乾燥LPSおよびATPは製造業者の指示に従って再構成されるべきである。再構成に続いて、LPSおよびATPは、さらに不完全なRPMI1640培地を使用して適正在庫の濃度に希釈することができる。
- よくそうLPSの最終的な作業濃度が1μg/ mLとなることLPSするだけでなく、LPSに加えてATPにLPSを追加。総刺激時間は3時間です。しかし、全血を2時間40分LPSで刺激される。サンプルは37℃、5％CO 2インキュベーター内に配置する必要があります。
- ATPは、3時間の刺激期間の残り20分間の間に追加されます。 ATP単独およびインキュベーターにおけるLPSとATPだけでなく、場所のサンプルにATPを追加。 ATPの最終的な作業濃度は2mmです。
- 3時間のインキュベーション期間の後、1.5 mlのマイクロチューブに各サンプルを小分けし、その後室温で2分間、10000回転で試料を遠心分離によって上清を集める。新しい1.5 mlチューブの別のセットに上清を移す。
- サンプルはすぐに一時的に-20℃または-80℃で長期保存に関してアッセイまたは保存することができます。
4。サイトカインアッセイ
- 凍結された試料は、分析前に室温に平衡化する必要があります。 IL -1βcanのサイトカイン濃度は、さまざまな方法を用いて評価する。我々は、ベンダの指示に従って、バイオプレックス200システムでXプレックスアッセイバイオプレックスProのヒトサイトカインを利用する。このプロトコルでは、特にIL -1βを測定しているが、我々は、同時に少量のサンプル量を使用することの利点を使用すると、ワンアッセイで複数のサイトカインを測定するために、この多重サイトカインアッセイを利用しています。
5。代表的な結果
LPSとATPとの正常な刺激によりIL -1β産生の解析は何を示していますSE刺激される細胞の数に依存して応答。我々は、2.0 × 10 6細胞/ mLのIL -1βの最適化と測定可能な濃度だけでなく、他のサイトカイン（図2）を生成するのに十分な濃度であることを見出した。
全血アッセイは、自己炎症症状を呈する患者を研究するのに有用である。これらの患者は、LPS単独で（図3）による刺激によりIL -1βの過剰産生（対照と比較した場合）によって特徴付けることができる自然免疫系、に欠陥が表示されることがあります。
図1。希釈全血サンプル中の細胞濃度を決定するために使用される核白血球のAO染色の代表的なイメージ。
図2 IL -1β産生は増加する細胞の濃度でLPS刺激時に 健康なドナーから全血上清で測定。サンプルは三重にアッセイされた。
図3。2人の健常正常コントロールと同様にIL -1β関連自己炎症症状を呈する患者2人から全血上清中で測定されたIL -1β分泌の代表的な結果。
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Discussion
説明した全血アッセイは、細胞の単離と豊富なサンプルの処理や操作を必要とする他の手法と比較してより密接に生理学的条件を模倣する簡単な方法です。このメソッドは、全血での白血球細胞をカウントするためにAOでCellometerビジョンを利用し、したがって、正確に細胞数に基づいてサンプルを標準化する方法を提供します。
それは他の抗凝固剤が知られているカルシウムのキレート剤であるため、アッセイの結果に影響を与えることができるようにこのアッセイのために、全血をヘパリンナトリウムのコレクションチューブに描かれるべきことに留意する必要があります。これはサイトカインの濃度に影響を与える可能性があるため、無血清培地にも使用する必要があります。また、重要な一回得られたサンプルの即時処理です。説明する方法が全血と対策IL -1βconcentrationを刺激するLPSおよびATPを使用していますが、他の病原体と刺激が刺激によって、様々なサイトカインやケモカイン応答を測定するために使用することができますが、刺激の時間と条件は、それに応じて調整する必要があります。最後に、一定の凍結融解は、サイトカインの濃度に影響を与える可能性があります。
説明した全血を刺激アッセイを利用してIL -1βの検出は、他の方法への代替を提供し、炎症関連病態を伴う疾患を研究するために効果的な免疫測定法です。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この研究は、関節炎および国立衛生研究所の筋骨格系と皮膚病研究所の学内研究プログラムによってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Heparin Blood Collection Tubes | BD Biosciences | 366480 | |
| RPMI 1640 Media | GIBCO, by Life Technologies | 21870-100 | |
| Acridine Orange | Invitrogen | A3568 | |
| Cellometer Vision | Nexcelom Bioscience | Contact company for instrument information | |
| Cellometer Cell Counting Chambers | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100 | |
| 24-well Tissue Culture Plate | Corning | 3524 | |
| Ultra Pure E. coli K12 LPS | Invitrogen | tlrl-eklps | |
| Adenosine 5´-tripohasphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Bio-plex 200 system | Bio-Rad | Contact company for instrument information | |
| Bio-Plex Pro human cytokine x-plex assay | Bio-Rad | x-plex assays are custom made according to specified cytokines of interest |
References
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