Summary
Biz autoinflammatory fenotipleri ile başvuran hastalarda, IL-1 beta üretim gibi pro-inflamatuar sitokinlerin üretimi, ölçmek için basit bir immunoassay açıklar. Özellikle lipopolisakkarid patojen ilişkili moleküler paternleri, tam kan kültürlerinde hücreleri aktive ederek, sitokin salgılanması tam kan Süpernatantları rahatlıkla değerlendirilebilir.
Abstract
İnflamatuar süreçleri, bağışıklık hücreleri tarafından çözünür mediatörlerin salgılanmasını kaynaklanan cilt, eklemler ve diğer dokular gibi değişmiş sitokin homeostazı çeşitli tezahürleri yol. Doğuştan gelen bağışıklık sistemi, patojenler ve diğer endojen tehlike uyaranlara tanıma çok önemli bir rol oynar. Doğuştan gelen bağışıklık hücreleri tarafından yayımlanan önemli sitokinlerin biri İnterlökin (IL) -1. Bu nedenle, inflamatuvar sitokinlerin salgılanmasını ölçmek için ve özellikle pro-inflamatuar sitokin IL-1β 1, 2, 3, tam kan stimülasyon tahlil kullanmaktadır.
Autoinflammatory sendromlar neden olan doğuştan gelen bağışıklık sisteminin genetik işlev bozuklukları olan hastalar sadece LPS ile uyarılması üzerine IL-1β olgun abartılı bir sürümü göstermektedir. Doğuştan gelen bağışıklık bileşeni ile ilişkili inflamatuar patolojileri ile başvuran hastaların değerlendirilmesi amacıyla, gram-negatif bakteriyel endotoksin gibi patojen ilişkili moleküler kalıplarını (PAMPs), hücresel immün yanıtları tespit etmek için belirli bir immunoassay, lipopolisakkarit (LPS .) Bu PAMPs, doğuştan gelen bağışıklık sistemi 4, 5, 6, 7 hücreleri üzerinde bulunan patojen tanıma reseptörleri (PRRs) tarafından kabul edilmektedir . Ile birlikte ikincil bir sinyal, ATP, inflammasome, olgun, biyoaktif formda 4, 5, 6, 8, 9 pro-IL-1β işlediği bir multiprotein kompleksinin aktivasyonu için gerekli bir temel sinyal, LPS, 10
Tam kan tahlil belirli hücre popülasyonlarının emek yoğun izolasyon ve kültür gerektiren diğer yöntemleri ile kıyaslandığında sitokin üretimini değerlendirmek için minimum numune manipülasyon gerektirir. Bu yöntem diğer tüm kan stimülasyon testleri farklıdır; RPMI medya oranına sahip numunelerin seyreltilmesi daha ziyade, bir beyaz kan hücresi doğrudan seyreltilmiş tam kan sayımı ve bu nedenle, kültür 2 beyaz kan hücrelerinin sayısı bilinen bir teşvik gerçekleştirmek. Özellikle tüm bu kan testinin sonuçları autoinflammatory pathophysiologies ile başvuran hasta kohortlarında nedenlerine açıklık kullanışlı yeni bir teknik ortaya koymaktadır.
Protocol
1. Tam Kan Toplanması
- Etkilenen bireylerin yanı sıra yaş ve cinsiyet eşleştirilmiş sağlıklı kontroller en az 10 ml periferik kan alın. Venöz kan sodyum heparin ile uygun bir karışım sağlamak için diğer antikoagülanlar, EDTA, ve ters birkaç kez kullanarak daha ziyade, sodyum heparin vacutainer kan alma tüpleri içine alınmalıdır. 10 ml tam kan, bu özel tahlil için yinelenen kaplama örnekleri için gerekli minimum hacmi olduğunu unutmayın.
- Örnekleri, en iyi sonuçlar için toplandıktan sonra mümkün olduğunca çabuk işleme tabi tutulmalıdır. Ancak, işlenmek üzere (2) hazır olana kadar 24 saate kadar heparinize kan loş ışık altında oda sıcaklığında muhafaza edilebilir.
2. Tam Kan hazırlanması
- Oda sıcaklığında az on dakika 3000 rpm (fren kapalı açık olan) tüm kan örnekleri santrifüjleyin. Buffy coat bozmadan, plazma üst toplanan ve diğer deneysel amaçlar için depolanır. Plazma örnekleri -20 ° C veya -80 ° C Uzun süreli depolama için geçici olarak saklanabilir
- Bir kez toplanan plazma, serum serbest (eksik) RPMI 1640 medya (ortam sıcaklığında), kırmızı kan hücre (RBC) pelet ve buffy coat resuspending örnekleri yıkayın. Toplama tüpleri karışımı yavaşça pipet ve 50 ml konik tüp transferi.
- 50 ml eksik RPMI 1640 kültür ortamı ve hafifçe, homojen bir karışım oluşturmak için tüpler ters Cilt. On dakika için 3000 rpm (fren kapalı açık olan) numuneleri santrifüjleyin. Emin olmak için net bir ayrım var, buffy coat rahatsız etmemek için dikkatli olmak, süpernatant aspirat. Bu prosedür tüm kirleticiler ve bağlı sitokinlerin uyarımı önce kaldırıldığından emin olmak için 2-4 kez tekrarlayın.
- Son yıkamadan sonra, eksik RPMI 1640 medya ile toplam hacmi 20 ml (10 ml tam kan çekilir), böylece RBC pelet ve buffy coat tekrar süspansiyon haline getirin. Toplam hacmi çekilir kan hacmine göre ayarlanabilir.
- Cellometer Vizyon kullanarak, seyreltilmiş kan akridin oranj (AO) kullanarak beyaz kan hücre sayımı seçeneği seçerek parçalama eritrositlerde olmadan sayılabilir. Bir kısım seyreltilmiş kan bir parçası AO ve yük bir tek sayma odasına 1:1 karışımı 20 mcL ekleyin. AO seyreltme sonra nihai konsantrasyonu 1μg/mL olmalıdır.
- 2.0 x 10 6 hücre / ml son bir hücre konsantrasyonu eksik RPMI 1640 medya ile buna göre ayarlayın.
3. Tam Kan uyarılması
- En az dört koşul (her iki nüsha) bir tahlil gerektirir: unstimulated, yalnız LPS Ayrıca, ATP sadece ek ve nihayet LPS artı ATP birbirine eklenir. 24 iyi doku kültürü plakası uygun kuyuya hazırlanan 2.0 x 10 6 hücre / ml seyreltilmiş tam kan 1 ml ekleyin.
- Uyarıcılar stimülasyon testinin başlamadan önce sulandırılmış ve oda sıcaklığına getirilmelidir. Liyofilize LPS ve ATP, üreticinin talimatlarına göre sulandırılmış olmalıdır. Sulandırıldıktan sonra, LPS ve ATP daha uygun bir stok konsantrasyonu eksik RPMI 1640 ortamını kullanarak sulandırılmış olabilir.
- LPS son çalışma konsantrasyonu 1 mcg / ml olduğunu LPS yanı sıra LPS artı ATP LPS ekleyin. Toplam uyarılma süresi 3 saattir. Ancak, tam kan, 2 saat ve 40 dakika için LPS ile uyarılır. Örnekler 37 ° C ve% 5 CO 2 'de bir kuluçka konulmalıdır .
- ATP, 3 saat stimülasyon süre kalan 20 dakika boyunca eklenir. ATP ATP yalnız ve LPS ve inkübatör ATP iyi ve yeri örnekleri ekleyin. ATP son çalışma konsantrasyonu 2mm.
- 3 saat kuluçka döneminden sonra, her bir örnek 1.5 mL mikrosantrifüj tüpe aliquoting ve daha sonra oda sıcaklığında 2 dakika 10.000 rpm'de santrifüj örnekleri süpernatantlar toplamak. 1.5 mikrosantrifüj tüpler başka bir set süpernatantlar aktarın.
- Örnekler hemen -20 ° C veya -80 ° C 'de uzun süreli depolama için geçici olarak test veya saklı olabilir.
4. Sitokin Testi
- Donmuş numuneler analizden önce oda sıcaklığına gelmesini gerekir. IL-1βcan sitokin konsantrasyonları çeşitli yöntemler kullanılarak değerlendirildi. Biz üreticinin talimatlarına göre, x-Bio-Plex 200 sistemi karmaşık tahlil Bio-Pro karmaşık insan sitokin kullanmaktadır. Bu protokolde, özellikle IL-1β ölçüm vardır, ancak biz küçük bir örnek hacmi kullanarak parası ile aynı anda birden fazla sitokinler ölçmek için bir tahlil için bu multipleks sitokin tahlil kullanmaktadır.
5. Temsilcisi Sonuçlar
LPS ve ATP ile başarılı uyarılması üzerine IL-1β üretim analizi yapmak gösterirse uyarılmış olan hücrelerin sayısına bağlı tepki. 2.0 x 10 6 hücre / mL, IL-1β optimal ve ölçülebilir açabildiği gibi, diğer sitokinlerin (Şekil 2) üretmek için yeterli bir konsantrasyon olduğunu bulduk .
Tam kan testleri autoinflammatory belirtileri ile başvuran hastaların eğitim yararlıdır. Bu hastalar, doğuştan gelen bağışıklık sistemi, IL-1β LPS tek başına (Şekil 3) ile uyarılması üzerine aşırı üretim (kontrol grubu ile karşılaştırıldığında) ile karakterize edilebilecek bir kusur gösterebilir.
Şekil 1 çekirdekli beyaz kan hücreleri için seyreltilmiş tam kan örneklerinde hücre konsantrasyonunu belirlemek amacıyla kullanılan AO boyama Temsilcisi görüntü.
Şekil 2, IL-1β üretimi artan hücre konsantrasyonlarda LPS ile uyarılması üzerine sağlıklı bir donörden tam kan Süpernatantları ölçülür. Numuneler üç nüsha olarak ölçüldü.
Şekil 3 İki sağlıklı normal kontrollerin yanı sıra, IL-1β ilişkili autoinflammatory belirtileri ile başvuran iki hastanın tam kan süpernatantlar ölçülen IL-1β salgılanması Temsilcisi sonuçları .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Açıklanan tüm kan testi, hücre izolasyonu ve geniş bir örnek işleme ve manipülasyon gerektirir diğer tekniklere göre daha fizyolojik koşulları yakından taklit eden basit bir yöntem. Bu yöntem, beyaz kan hücrelerinin tüm kan sayımı ve bu nedenle, doğru hücre sayıları dayalı örnekleri standartlaştırmak için bir yol sağlar AO ile Cellometer Vizyon kullanır.
Bu testte, tam kan, diğer antikoagülanlar kalsiyum şelatlar bilinen sodyum heparin toplama tüpleri içine çekilmiş olmalı ve böylece testinin sonuçlarını etkileyebilir olduğu unutulmamalıdır. Bu sitokin konsantrasyonları etkileyebilir, çünkü serum serbest medya da kullanılmalıdır. Ayrıca önemli bir kez elde edilen örneklerin hemen işleme. Ancak, açıklanan yöntem, tam kan uyarmak için LPS ve ATP kullanır ve IL-1βconcentration, diğer patojenler ve uyaranlara stimülasyon üzerine çeşitli sitokin ve kemokin tepkileri ölçmek için kullanılabilir önlemler; stimülasyon süreleri ve koşulları buna göre ayarlanması gerekebilir. Son olarak, sürekli donma-çözülme döngüsünden sitokin konsantrasyonları etkileyebilir.
IL-1β tespiti açıklanan tüm kan stimülasyon testinin kullanan diğer yöntemlere bir alternatif sağlar ve hastalıkları ile ilişkili inflamatuar patolojileri ile çalışma etkili bir kitidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Artrit ve Kas-iskelet ve Cilt Hastalıkları Ulusal Enstitüsü İntramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Heparin Blood Collection Tubes | BD Biosciences | 366480 | |
| RPMI 1640 Media | GIBCO, by Life Technologies | 21870-100 | |
| Acridine Orange | Invitrogen | A3568 | |
| Cellometer Vision | Nexcelom Bioscience | Contact company for instrument information | |
| Cellometer Cell Counting Chambers | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100 | |
| 24-well Tissue Culture Plate | Corning | 3524 | |
| Ultra Pure E. coli K12 LPS | Invitrogen | tlrl-eklps | |
| Adenosine 5´-tripohasphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Bio-plex 200 system | Bio-Rad | Contact company for instrument information | |
| Bio-Plex Pro human cytokine x-plex assay | Bio-Rad | x-plex assays are custom made according to specified cytokines of interest |
References
- Martinon, F., Mayor, A., Tschopp, J. The inflammasomes: guardians of the body. Annu Rev Immunol. 27, 229-265 (2009).
- Thurm, C. W., Halsey, J. F. Measurement of cytokine production using whole blood. Curr Protoc Immunol. 66, 7-18 Forthcoming.
- Mariathasan, S. Cryopyrin activates the inflammasome in response to toxins and ATP. Nature. 440, 228-232 (2006).
- Gabay, C., Lamacchia, C., Palmer, G. IL-1 pathways in inflammation and human diseases. Nat Rev Rheumatol. 4, 232-241 (2010).
- Franchi, L., Elgenbrod, T., Muñoz-Planillo, R., Nuñez, G. The inflammasome: a caspase-1-activation platform that regulates immune responses and disease pathogenesis. Nat Immunol. 3, 241-247 (2009).
- Sims, J. E., Smith, D. E. The IL-1 family: regulators of immunity. Nat Rev Immunol. 2, 89-102 (2010).
- Haug, R., Joø, G. B., Westvik, A. B., Kierulf, P. Chemokine production and pattern recognition receptor (PRR) expression in whole blood stimulated with pathogen-associated molecular patterns (PAMPs. Cytokine. 32, 304-315 (2005).
- Netea, M. G. Differential requirement for the activation of the inflammasome for processing and release of IL-1bin monocytes and macrophages. Blood. 113, 2324-2335 (2009).
- Latz, E. The inflammasomes: mechanisms of activation and function. Curr Opin Immnol. 22, 28-33 (2010).
- Masters, S. L., Simon, A., Aksentijevich, I., Kastner, D. L. Horror autoinflammaticus: the molecular pathophysiology of autoinflammtory disease. Annu Rev Immunol. 27, 621-668 (2009).
