موت الخلايا المبرمج المقايسات التي يشيع استخدامها في نظم الثدييات مثل الحمض النووي أو المقايسات laddering النفق ، وغالبا ما يصعب استنساخها في النباتات. في توليفة مع نظام مراسل GUS ، نقترح السريع ، ومحطة عابرة مقايسة يستند إلى تحليل خصائص الموت المحتملة للجينات معينة.
وقد طورنا رواية التعبير محطة عابرة في وقت واحد يعبر عن نظام الجين المراسل ، β غلوكورونيداز (GUS) ، مع المنظمين المفترضين الإيجابية أو السلبية لموت الخلية. في هذا النظام ، N. ويترك benthamiana المشترك تسللت مع الكاسيت التي تحتوي على التعبير مدفوعة 35S الجين لتحليلها ، وناقلات GUS pCAMBIA 2301 باستخدام الأجرعية LBA4404 سلالة كوسيلة. لأن هناك حاجة الخلايا الحية للتعبير GUS تحدث ، ومن المتوقع فقدان النشاط GUS عند هذا الجين علامة المشترك مع المنظمين وأعرب الإيجابية للموت الخلية. على قدم المساواة ، وزيادة النشاط GUS لوحظ عند استخدام الجينات المضادة للأفكارك مقارنة مكافحة النواقل. كما هو مبين أدناه ، وقد استخدمنا هذا النظام بنجاح في المختبر لتحليل كل من اللاعبين المؤيدة والمناهضة للموت. وتشمل هذه المحطة لمكافحة أفكارك بي سي إل 2 المرتبطين athanoGene (BAG) عائلة ، فضلا عن المعروف محرضات الثدييات من موت الخلايا ، مثل BAX. بالإضافة إلى ذلك ، فقد استخدمنا هذا النظام لتحليل وظيفة فاة truncations محددة داخل البروتينات ، التي يمكن أن تقدم أدلة على تعديل محتمل في مرحلة ما بعد متعدية / تفعيل هذه البروتينات. هنا ، نقدم طريقة سريعة والنباتات الحساسة القائمة ، كخطوة أولية في التحقيق في وفاة وظيفة للجينات معينة.
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Rifampicin | VWR | IC19549001 | 25mg/mL stock in DMSO |
4′-hydroxy-3′,5′-dimethoxyacetophenone (Acetosyringone) | VWR | TCD2666 | 0.981 g/mL in DMSO (1M stock) |
2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate (MES) | VWR | EM-6110 | 1.92 g/L in water for making 1 L of infiltration media |
Bacto-tryptone | Fisher | BP1421-2 | 10g/L in water for making 1 L of LB medium |
Bacto-yeast extract | VWR | EM1.03753.0500 | 5g/L in water for making 1 L of LB medium |
Sodium chloride | VWR | EM-7710 | 10g/L in water for making 1 L of LB medium |
Sodium phosphate monobasic monohydrate | VWR | MK-7868-12 | 2.5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi |
Sodium phosphate dibasic heptahydrate | VWR | EMD-SX0715-1 | 5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi |
Magnesium sulfate heptahydrate | VWR | EM-MX0070-1 | 2.5 g/L in water for making 1 L of infiltration media |
N-Lauroylsarcosine | VWR | TCL0151-500G | 0.1% v/v in GUS buffer |
5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronide cyclohexylammonium salt (X-gluc) | Gold Biotechnology | G1281C | 1mg/100uL in methanol 100% |
4-Methylumbelliferyl-μ-D-glucuronide hydrate (MUG) | Sigma | M5664 | 2 mM in 100 uL of GUS extraction buffer |
Potassium ferrocyanide trihydrate | VWR | EM-PX1460-1 | 100mM stock for X-gluc substrate solution |
β-Methylumbelliferone (MU) | Sigma-Aldrich | M1381 | For MU standard curve use GUS extraction buffer |
Sodium carbonate | VWR | EM-SX0395-11 | 0.2 M in water for making GUS stop buffer |