Summary
פרוטוקול זה מראה כיצד retrogradely תווית בתאי הגנגליון ברשתית, וכיצד לאחר מכן לבצע פגיעה בעצב הראייה לרסק על מנת לנתח הגנגליון ברשתית בתא הישרדות אפופטוזיס. זהו מודל מחלה ניסויית עבור סוגים שונים של נוירופתיה אופטית, כולל גלאוקומה.
Abstract
פגיעה בעצב הראייה עלולה להוביל לניוון axonal, ואחריו מוות הדרגתי של תאים ברשתית הגנגליון (RGCs), שתוצאתה אובדן ראייה בלתי הפיך. דוגמאות של מחלות כאלה האדם כוללות נוירופתיה אופטית טראומטית ניוון עצב הראייה של גלאוקומה. הוא מאופיין על ידי שינויים טיפוסי בראש עצב הראייה, ניוון עצבי פרוגרסיבי אופטיים, ואובדן של תאים הגנגליון ברשתית, אם לא מבוקרת, מה שמוביל לאובדן ראייה ועיוורון.
עצב הראייה למחוץ (ONC) פגיעה במודל עכבר הוא מודל חשוב מחלה ניסויית עבור נוירופתיה אופטית טראומטי, גלאוקומה, וכו 'במודל זה, למחוץ את הפגיעה בעצב הראייה מוביל הדרגתי אפופטוזיס בתאי הגנגליון ברשתית. מודל זה המחלה יכול לשמש כדי לחקור את התהליכים הכלליים מנגנוני מוות עצבי והישרדות, שהוא חיוני לפיתוח אמצעים טיפוליים. בנוסף, גישות תרופתי מולקולרית ניתן להשתמש במודל זה כדי לזהות ולבדוק ריאגנטים טיפולית פוטנציאל לטפל בסוגים שונים של נוירופתיה אופטית.
כאן, אנו מספקים צעד אחר צעד הפגנה של (אני) תיוג Baseline מדרדר התאים הגנגליון ברשתית (RGCs) ביום 1, (II) עצב הראייה למחוץ פגיעה בכל יום 4, (III) קציר רשתיות ולנתח הישרדות RGC ביום 11, ו - (IV) תוצאה נציג.
Protocol
כל ציוד ריאגנטים בהם נעשה שימוש הם עקרים. כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה (ACUC) בשעה ניי / NIH (פרוטוקול המחקר בבעלי חיים ניי-570), וכן בוצעו על פי הנחיות NIH והתקנות.
1. Baseline תיוג מדרדר לתאי הגנגליון של הרשתית (RGCs) ביום 1
מטרת הליך זה היא תווית לתאי הגנגליון ברשתית retrogradely ידי הזרקת צבע נותב עצביים לתוך colliculus מעולה של עכברים שלושה ימים לפני הפציעה עצב הראייה למחוץ. לצבוע יילקחו retrogradely על ידי התאים הגנגליון ברשתית ומספק סמן את RGCs חיים (איור 1). גישה זו מניבה תיוג לשחזור של RGCs קיימא עם וריאציה מעט 1-5.
- עמוק להרדים את העכבר. נקו את השיער בחלק העליון של הראש. מניחים את העכבר במנגנון stereotaxic קטן. Oinment מגן מוחל על שתי העיניים. לחטא את עור הראש שלוש פעמים באמצעות iodophor ו לשפשף באלכוהול 70%.
- עושים חתך בעור לחשוף את הגולגולת, ולשמור אותו יבש ונקי באמצעות מי חמצן 3%.
- זיהוי לציון גבחת. לקדוח חור מעל colliculus הממונה על 2.9 מ"מ מאחורי גבחת ו 0.5 מ"מ לרוחב קו האמצע של כל האונה 7. במהלך הקידוח, להחיל מלוחים לאתר שבו הוא קדח חור כדי למנוע פגיעה חום משני.
- באמצעות מכשיר מדידה stereotaxic ומזרק המילטון, להזריק העצבית FluoroGold נותב צבען (1 μl של 3% ב Fluorochrome מלוחים) לאט לאט לתוך colliculus מעולה של האונה כל בעומק של 1.6 מ"מ ממשטח הגרמי של המוח.
- תפר את האתר החתך. תן הזרקה תת עורית של עצירות על שיכוך כאבים.
- הזז את העכבר לאזור חם ויבש ולנטר אותו עד שהוא מסוגל לשמור על יציבה זקופה, ולהחזיר אותו בכלוב בבית שלה. במשך שלושת הימים הראשונים לאחר הניתוח תיוג, משככי כאבים מערכתית (למשל, עצירות) וכן משחה אנטיביוטית מקומית ניתנים פעמיים ביום את העכבר הוא פיקוח הדוק.
2. עצב הראייה קראש פגיעה באותו יום 4
בהליך זה, אנו תחול פגיעה למחוץ את עצב הראייה לגרום נזק ראשוני של אקסונים (איור 2), אשר יוביל למוות הדרגתי של התאים הגנגליון ברשתית.
- שלושה ימים לאחר היישום נותב צבע, העכבר נמצא בהרדמה עמוקה. באמצעות מיקרוסקופ לנתח, לחמית העין אחד הוא חרות על כ בעמדה 4 לפנות באמצעות מספריים האביב.
- להסיט בעדינות את השרירים מסלולית ולשים אותם בצד. לחשוף את עצב הראייה לבן ביציאה מן העולם את העין. קח בזהירות רבה לא כל נזק כלי הדם.
- בעזרת זוג צולבות פעולה מלקחיים, להחיל פציעה למחוץ את עצב הראייה על כ - 2 מ"מ מפני גלגל העין במשך כ 3 שניות. קח בזהירות רבה שלא לפגוע בעורק עיניים כדי לגרום לדימום.
- לאחר השלמת הפגיעה למעוך, החתך הוא sutured.
- לפני העכבר מתאושש מההרדמה, לתת הזרקה תת עורית של עצירות של שיכוך כאבים.
- הזז את העכבר לאזור חם ויבש ולנטר אותו, עד שהוא מסוגל לשמור על יציבה זקופה ולהחזיר אותו בכלוב בבית שלה. במשך שלושת הימים הראשונים לאחר ההליך פגיעה למעוך, משככי כאבים מערכתית (למשל, עצירות) וכן משחה אנטיביוטית מקומית ניתנים פעמיים ביום את העכבר הוא פיקוח הדוק.
3. קציר רשתיות ולנתח הישרדות RGC ביום 11
מטרת הליך זה היא לקצור retinaeto לנתח הישרדות תא גנגליון ברשתית.
- באותו יום 11 (יום 7 אחרי ONC), העכבר הוא מורדמים על ידי עירוי CO 2 ו נקע בצוואר הרחם.
- העיניים הן enucleated בעזרת זוג מלקחיים על ידי הפעלת לחץ על מסלול.
- העיניים הן פתרון קבוע paraformaldehyde 4% למשך שעתיים לרחוץ PBS שלוש פעמים. לנתח את הרשתית. ההליך של דיסקציה הרשתית כבר פורסם בעבר ב 2010 על ידי יופיטר על ידי Gustmann, S. et al. 6, ולכן לא יהיה המתואר כאן.
- תמונות של התאים ששרדו הגנגליון ברשתית נלקחים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי באזורים מוגדרים של הרשתית, ועל הרשתית צפיפות תא גנגליון ניתן לספור. התוצאה נציג את הקרינה שכותרתו בתאי הגנגליון ברשתית עם או בלי פגיעה עצב הראייה למחוץ מוצג באיור 3.
4. נציג תוצאות:
כדי לנתח הגנגליון ברשתית תאים והישרדות, שבעה ימים לאחר פציעה עצב הראייה למעוך, רשתיות נבצרו קבועה, שטוח ועלה. תמונות הרשתית נלקחו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בהשוואה r הרגיל וללא כל פגעetina (משמאל, רגיל), מספר RGCs קיימא (ירוק, שכותרתו retrogradely על ידי צבע עצביים נותב FluoroGold מוזרק לתוך colliculus מעולה) הוא נמוך משמעותית רשתיות עם פציעה למחוץ עצב הראייה (ימין, ONC) (איור 3) .
באיור 1. Baseline מדרדר תיוג של תאים הגנגליון ברשתית
כדי לספור את התאים קיימא הגנגליון ברשתית בנקודות זמן שונות לאחר פציעה עצב הראייה למחוץ, התאים הגנגליון ברשתית מסומנים retrogradely באמצעות הזרקת עצביים נותב צבע (הצבע הירוק) לתוך colliculus מעולה בשלושת הימים המוח לפני עצב הראייה ( אדום) למחוץ פציעה. מאז האקסונים של התאים הגנגליון ברשתית מתגוררים colliculus מעולה, לצבוע נותב יהיה תפוס על ידי RGCs retrogradely ומספק סמן את RGCs חיים.
איור 2. עצב הראייה למחוץ פציעה
על מנת לנתח את המצב של הישרדות הגנגליון ברשתית התא, פגיעה למחוץ מוחל על עצב הראייה (אדום) כדי לגרום נזק ראשוני של אקסונים. זה יוביל למוות הדרגתי של התאים הגנגליון ברשתית. שלושה ימים לאחר הזרקת צבע (ירוק) נותב, העכבר הוא מורדם. לחמית העין הוא חרות. להסיט את השרירים מסלולית ולשים אותם בצד. לחשוף את עצב הראייה ביציאה מן העולם את העין. החלת פציעה למחוץ את עצב הראייה על כ - 2 מ"מ מפני גלגל העין במשך כ 3 שניות בעזרת זוג צולבות פעולה מלקחיים.
איור 3. Fluorescence שכותרתו הגנגליון ברשתית תאים עם או בלי פגיעה עצב הראייה למחוץ
כדי לנתח הגנגליון ברשתית תאים והישרדות, שבעה ימים לאחר פציעה עצב הראייה למעוך, רשתיות נבצרו קבועה, שטוח ועלה. תמונות הרשתית נלקחו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בהשוואה הרשתית רגיל ללא פגע (משמאל, רגיל), מספר RGCs קיימא (ירוק, שכותרתו retrogradely ידי העצבית FluoroGold נותב צבע המוזרק colliculus מעולה) היה נמוך משמעותית רשתיות עם פציעה למחוץ עצב הראייה (ימין, ONC ) (תרשים 3). בר קנה מידה: 50 מיקרומטר
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עצב הראייה למחוץ פציעה מודל Murine שימושי ללמוד את התהליך של מוות הישרדות RGC ו. מודל זה הוא גם משמש לעתים קרובות כדי לחקור את ההשפעות של ריאגנטים גנים שונים על אפופטוזיס הישרדות RGC ו. אחד היתרונות של המודל הזה היא כי יש רמה גבוהה של שחזור עם שינויים מינימליים.
עם זאת, טיפול מיוחד נדרש מספר שלבים במודל זה. ראשית, בעת ביצוע הפגיעה בעצב הראייה למחוץ, חשוב לא להשתמש בכוח רב מדי לא לרסק יותר מדי זמן, כי הם עלולים לגרום נזק העורק עיניים ו איסכמיה ברשתית לאחר מכן ולכן. בנוסף, כאשר מנסים לחשוף את עצב הראייה, אחד צריך לקחת בזהירות רבה כדי לא לפגוע בכלי הדם האחרים המקיפים את העין העכבר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
המחקר שלנו הוא נתמך על ידי תוכנית המחקר עירונית של, NIH National Eye Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic apparatus | ASI Instruments | SAS-4100 | |
| Dissecting microscope | World Precision Instruments, Inc. | PZMIV-BS | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel Blades #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Microdrill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| Suture needle | Fine Science Tools | 12050-03 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 16144-13 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Co | 88400 | |
| Gauze sponges | Office Depot | 674889 | |
| Fluorochrome | Sigma-Aldrich | 39286 | |
| Alcohol | Sigma-Aldrich | 459844 | 70% |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H3410 | 3% |
References
- Yoles, E. GM1 reduces injury-induced metabolic deficits and degeneration in the rat optic nerve. Investigative ophthalmology & visual science. 33, 3586-3591 (1992).
- Fisher, J. Vaccination for neuroprotection in the mouse optic nerve: implications for optic neuropathies. J Neurosci. 21, 136-142 (2001).
- Levkovitch-Verbin, H. RGC death in mice after optic nerve crush injury: oxidative stress and neuroprotection. Investigative ophthalmology & visual science. 41, 4169-4174 (2000).
- Li, Y. VEGF-B inhibits apoptosis via VEGFR-1-mediated suppression of the expression of BH3-only protein genes in mice and rats. The Journal of clinical investigation. 118, 913-923 (2008).
- Tang, Z. Survival effect of PDGF-CC rescues neurons from apoptosis in both brain and retina by regulating GSK3beta phosphorylation. The Journal of experimental medicine. 207, 867-880 (2010).
- Gustmann, S., Dunker, N. In vivo-like organotypic murine retinal wholemount culture. J Vis Exp. , (2010).
- Franklin, K., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. San Diego. (1997).
