Summary
इस प्रोटोकॉल पता चलता है कि कैसे retrogradely रेटिनल नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं, और कैसे करने के लिए बाद में एक ऑप्टिक तंत्रिका कुचलने चोट करने में रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल अस्तित्व और apoptosis का विश्लेषण लेबल. यह ऑप्टिक न्युरोपटी के मोतियाबिंद सहित विभिन्न प्रकार, के लिए एक प्रयोगात्मक रोग मॉडल है.
Abstract
ऑप्टिक तंत्रिका चोट axonal अध: पतन के लिए नेतृत्व, रेटिनल नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं (RGCs), जो अपरिवर्तनीय दृष्टि हानि में परिणाम के एक क्रमिक मौत द्वारा पीछा कर सकते हैं. मानव में इस तरह के रोगों के उदाहरण दर्दनाक ऑप्टिक न्युरोपटी और मोतियाबिंद में ऑप्टिक तंत्रिका अध: पतन शामिल है. यह ऑप्टिक तंत्रिका सिर में विशिष्ट परिवर्तन, प्रगतिशील ऑप्टिक तंत्रिका अध: पतन, और रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के नुकसान, अगर अनियंत्रित, दृष्टि हानि और अंधापन के लिए अग्रणी द्वारा विशेषता है.
ऑप्टिक तंत्रिका को कुचलने (ONC) चोट माउस मॉडल दर्दनाक ऑप्टिक न्युरोपटी के लिए एक महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक रोग मॉडल, मोतियाबिंद, आदि इस मॉडल में, कुचलने ऑप्टिक तंत्रिका क्रमिक रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं apoptosis के लिए होता है चोट है. यह रोग मॉडल neuronal मौत और अस्तित्व, जो उपचारात्मक उपायों के विकास के लिए आवश्यक है की सामान्य प्रक्रियाओं और तंत्र का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, औषधीय और आणविक दृष्टिकोण इस मॉडल में इस्तेमाल किया जा सकता है की पहचान करने और ऑप्टिक न्युरोपटी के विभिन्न प्रकार के इलाज के लिए संभावित चिकित्सात्मक अभिकर्मकों परीक्षण करने के लिए.
यहाँ, हम (मैं) आधारभूत प्रतिगामी रेटिनल नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं की लेबलिंग (RGCs) 1 दिन में, (द्वितीय) 4 दिन में ऑप्टिक तंत्रिका कुचलने चोट, (iii) retinae हार्वेस्ट और दिन में RGC अस्तित्व का विश्लेषण के प्रदर्शन कदम के द्वारा एक कदम प्रदान 11, और (चतुर्थ) के प्रतिनिधि परिणाम.
Protocol
सभी उपकरणों और अभिकर्मकों बाँझ कर रहे हैं. सभी पशु प्रयोगों पशु देखभाल के द्वारा अनुमोदित किया गया और Nei / NIH पर समिति (ACUC) का उपयोग करें (पशु अध्ययन प्रोटोकॉल Nei-570), और थे एनआईएच दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार किया.
1. आधारभूत रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के प्रतिगामी दिवस 1 (RGCs) लेबल
इस प्रक्रिया के प्रयोजन के लिए रेटिनल नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं एक तंत्रिका ऑप्टिक तंत्रिका को कुचलने के चोट से तीन दिन पहले चूहों के बेहतर colliculus में ट्रेसर डाई इंजेक्शन द्वारा retrogradely लेबल है. डाई retrogradely रेटिनल नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं द्वारा किया जाएगा लिया और रहने वाले RGCs (चित्रा 1) के लिए एक मार्कर प्रदान करता है. इस दृष्टिकोण पैदावार थोड़ा 1-5 भिन्नता के साथ व्यवहार्य RGCs की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य लेबलिंग.
- गहरा माउस anesthetize. सिर के शीर्ष पर बाल साफ करो. एक छोटे stereotaxic तंत्र में माउस रखें. सुरक्षा oinment दोनों आंखों के लिए लागू किया जाता है. सिर त्वचा कीटाणुरहित तीन बार प्रत्येक एक iodophor और एक 70% शराब रगडें का उपयोग.
- खोपड़ी को बेनकाब करने के लिए त्वचा में एक चीरा बनाओ, और यह सूखी और साफ 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड का उपयोग कर रखना.
- पहचानें और bregma निशान. Bregma पीछे 2.9 मिमी और 0.5 मिमी प्रत्येक गोलार्द्ध 7 के midline पार्श्व में बेहतर colliculus ऊपर एक छेद ड्रिल. ड्रिलिंग के दौरान, साइट है जहाँ छेद के लिए माध्यमिक गर्मी चोट को रोकने के लिए drilled है खारा लागू.
- एक stereotaxic मापने डिवाइस और एक हैमिल्टन सिरिंज का प्रयोग, FluoroGold तंत्रिका ट्रेसर डाई (3% की एक μl खारा में Fluorochrome) बहुत धीरे धीरे मस्तिष्क की बोनी की सतह से 1.6 मिमी की गहराई में प्रत्येक गोलार्द्ध के बेहतर colliculus में इंजेक्षन.
- चीरा साइट सिवनी. Buprenorphine analgesia के लिए उपचर्म इंजेक्शन दे.
- एक गर्म और शुष्क क्षेत्र के लिए माउस ले जाएँ और यह की निगरानी जब तक यह एक ईमानदार मुद्रा बनाए रखने के लिए, और यह अपने घर पिंजरे के लिए वापस करने में सक्षम है. लेबलिंग प्रक्रिया के बाद पहले तीन दिनों के लिए, प्रणालीगत (उदाहरण के लिए, buprenorphine) दर्दनाशक दवाओं और सामयिक एंटीबायोटिक मलहम दो बार दैनिक दिया जाता है और माउस बारीकी से नजर रखी है.
2. 4 दिन ऑप्टिक नर्व क्रश चोट
इस प्रक्रिया में, हम ऑप्टिक तंत्रिका क्रश चोट लागू axons के लिए एक प्राथमिक क्षति (चित्रा 2), जो रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के एक क्रमिक मौत के लिए नेतृत्व करेंगे के कारण होगा.
- ट्रेसर डाई आवेदन के तीन दिन बाद, माउस गहरा anesthetized है. एक विदारक सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग, एक आँख के कंजाक्तिवा 4 बजे वसंत कैंची की एक जोड़ी का उपयोग कर स्थिति के बारे में छिन्न है.
- धीरे कक्षीय मांसपेशियों को मोड़ना और उन्हें डाल अलग है. आंख दुनिया से बाहर निकलने पर सफेद ऑप्टिक तंत्रिका बेनकाब. महान ख्याल रखना किसी भी रक्त वाहिकाओं को नुकसान नहीं है.
- पार कार्रवाई संदंश की एक जोड़ी की सहायता के साथ, ऑप्टिक तंत्रिका नेत्रगोलक से के बारे में 2 मिमी में के बारे में 3 सेकंड के लिए एक क्रश चोट लागू है. नेत्र धमनी से खून बह रहा का कारण नुकसान नहीं महान ख्याल रखना.
- क्रश चोट के पूरा होने के बाद, चीरा sutured है.
- इससे पहले माउस संज्ञाहरण से ठीक है, buprenorphine के analgesia के लिए एक उपचर्म इंजेक्शन दे.
- एक गर्म और शुष्क क्षेत्र के लिए माउस ले जाएँ और यह निगरानी, जब तक यह एक ईमानदार मुद्रा बनाए रखने के लिए और अपने घर पिंजरे के लिए वापस करने में सक्षम है. क्रश चोट प्रक्रिया के बाद पहले तीन दिनों के लिए, प्रणालीगत (उदाहरण के लिए, buprenorphine) दर्दनाशक दवाओं और सामयिक एंटीबायोटिक मलहम दो बार दैनिक दिया जाता है और माउस बारीकी से नजर रखी है.
3. Retinae हार्वेस्ट और 11 दिन में RGC जीवन रक्षा विश्लेषण
इस प्रक्रिया के प्रयोजन के लिए फसल retinaeto रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल अस्तित्व का विश्लेषण है.
- 11 (ONC बाद 7 दिन) दिन में, माउस सीओ 2 जलसेक और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के द्वारा euthanized है .
- आंखें कक्षा के लिए दबाव लागू करने के द्वारा संदंश की एक जोड़ी की मदद के साथ enucleated कर रहे हैं.
- आँखों 4% paraformaldehyde समाधान में दो घंटे के लिए तय कर रहे हैं और पीबीएस में तीन बार धोया. रेटिना काटना. रेटिना विच्छेदन की प्रक्रिया पहले से ही जौव द्वारा किया गया है पहले Gustmann एस, एट अल द्वारा 2010 में प्रकाशित 6, और इसलिए यहाँ वर्णित नहीं किया जाएगा.
- जीवित रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं की छवियाँ रेटिना की परिभाषित क्षेत्रों में एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन का उपयोग कर लिया जाता है, और रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल घनत्व गिना जा सकता है. प्रतिदीप्ति लेबल के साथ या बिना ऑप्टिक तंत्रिका कुचलने चोट रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं का एक प्रतिनिधि परिणाम 3 चित्र में दिखाया गया है.
4. प्रतिनिधि परिणाम:
रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल अस्तित्व, ऑप्टिक तंत्रिका को कुचलने की चोट के बाद सात दिनों का विश्लेषण करने के लिए, retinae काटा थे तय चपटी और घुड़सवार है. रेटिना छवियों को एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन का उपयोग कर ले जाया गया. रिहाई सामान्य आर के साथ तुलना मेंetina (बाएं, सामान्य), (हरे, retrogradely FluoroGold तंत्रिका ट्रेसर डाई बेहतर colliculus में इंजेक्शन द्वारा लेबल) व्यवहार्य RGCs की संख्या काफी एक ऑप्टिक तंत्रिका कुचलने चोट (सही, ONC) (चित्रा 3) के साथ retinae में कम है .
चित्रा 1. आधारभूत रेटिनल नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं की प्रतिगामी लेबलिंग
आदेश में ऑप्टिक तंत्रिका को कुचलने की चोट के बाद अलग अलग समय बिंदुओं पर व्यवहार्य रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं की गिनती करने के लिए, रेटिनल नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं retrogradely ऑप्टिक तंत्रिका से पहले मस्तिष्क तीन दिनों में बेहतर colliculus में एक तंत्रिका ट्रेसर डाई (हरे रंग) इंजेक्शन लगाने के द्वारा चिह्नित कर रहे हैं ( लाल) कुचलने चोट. के बाद से रेटिनल नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के axons बेहतर colliculus में रहते हैं, ट्रेसर डाई retrogradely RGCs द्वारा लिया जाएगा और रहने वाले RGCs के लिए एक मार्कर प्रदान करता है.
चित्रा 2. ऑप्टिक तंत्रिका को कुचलने चोट
आदेश में रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल अस्तित्व की स्थिति का विश्लेषण करने के लिए, एक क्रश चोट ऑप्टिक तंत्रिका (लाल) के लिए लागू किया जाता है axons के लिए एक प्राथमिक नुकसान का कारण. यह रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के एक क्रमिक मौत के लिए नेतृत्व करेंगे. ट्रेसर डाई इंजेक्शन (हरा) के तीन दिन बाद, माउस anesthetized है. एक आंख कंजाक्तिवा छिन्न है. कक्षीय मांसपेशियों को मोड़ना और उन्हें डाल अलग है. आंख दुनिया से बाहर निकलने पर ऑप्टिक तंत्रिका बेनकाब. क्रश पार कार्रवाई संदंश की एक जोड़ी का उपयोग के बारे में 3 सेकंड के लिए नेत्रगोलक से के बारे में 2 मिमी में ऑप्टिक तंत्रिका चोट लागू करें.
चित्रा 3. प्रतिदीप्ति लेबल ऑप्टिक तंत्रिका कुचलने चोट के साथ या बिना रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं
रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल अस्तित्व, ऑप्टिक तंत्रिका को कुचलने की चोट के बाद सात दिनों का विश्लेषण करने के लिए, retinae काटा थे तय चपटी और घुड़सवार है. रेटिना छवियों को एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन का उपयोग कर ले जाया गया. रिहाई सामान्य रेटिना (बाएं, सामान्य) के साथ तुलना में, व्यवहार्य RGCs की संख्या (हरे, retrogradely FluoroGold तंत्रिका ट्रेसर डाई बेहतर colliculus में इंजेक्शन द्वारा लेबल) ऑप्टिक तंत्रिका को कुचलने (चोट सही ONC, साथ retinae में काफी कम था ) (चित्रा 3). स्केल पट्टी: 50 सुक्ष्ममापी
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ऑप्टिक तंत्रिका को कुचलने चोट murine मॉडल RGC मृत्यु और जीवित रहने की प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है. यह मॉडल भी अक्सर RGC apoptosis और अस्तित्व पर अलग अभिकर्मकों और जीन के प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया. इस मॉडल का एक लाभ यह है कि यह कम से कम बदलाव के साथ reproducibility के एक उच्च डिग्री है.
हालांकि, इस मॉडल में कई चरणों में विशेष देखभाल की आवश्यकता है. सबसे पहले, जब ऑप्टिक तंत्रिका कुचलने चोट कर, यह बहुत अधिक बल का उपयोग नहीं और भी लंबे समय के लिए नहीं कुचलने, क्योंकि वे के लिए नेत्र धमनी और इसलिए बाद रेटिना ischemia को नुकसान के लिए नेतृत्व कर सकते हैं आवश्यक है. इसके अलावा, जब ऑप्टिक तंत्रिका बेनकाब करने की कोशिश कर रही है, एक महान ख्याल रखना अन्य रक्त माउस आँख आसपास वाहिकाओं को नुकसान नहीं होना चाहिए.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हमारे शोध एनआईएच, राष्ट्रीय नेत्र संस्थान के अंदर का रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic apparatus | ASI Instruments | SAS-4100 | |
| Dissecting microscope | World Precision Instruments, Inc. | PZMIV-BS | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel Blades #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Microdrill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| Suture needle | Fine Science Tools | 12050-03 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 16144-13 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Co | 88400 | |
| Gauze sponges | Office Depot | 674889 | |
| Fluorochrome | Sigma-Aldrich | 39286 | |
| Alcohol | Sigma-Aldrich | 459844 | 70% |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H3410 | 3% |
References
- Yoles, E. GM1 reduces injury-induced metabolic deficits and degeneration in the rat optic nerve. Investigative ophthalmology & visual science. 33, 3586-3591 (1992).
- Fisher, J. Vaccination for neuroprotection in the mouse optic nerve: implications for optic neuropathies. J Neurosci. 21, 136-142 (2001).
- Levkovitch-Verbin, H. RGC death in mice after optic nerve crush injury: oxidative stress and neuroprotection. Investigative ophthalmology & visual science. 41, 4169-4174 (2000).
- Li, Y. VEGF-B inhibits apoptosis via VEGFR-1-mediated suppression of the expression of BH3-only protein genes in mice and rats. The Journal of clinical investigation. 118, 913-923 (2008).
- Tang, Z. Survival effect of PDGF-CC rescues neurons from apoptosis in both brain and retina by regulating GSK3beta phosphorylation. The Journal of experimental medicine. 207, 867-880 (2010).
- Gustmann, S., Dunker, N. In vivo-like organotypic murine retinal wholemount culture. J Vis Exp. , (2010).
- Franklin, K., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. San Diego. (1997).
