Summary
Detta protokoll visar hur retrogradely att märka retinal ganglion celler, och hur man därefter gör en optisk skada synnerven krossa för att analysera näthinnan överlevnad ganglion celler och apoptos. Det är en experimentell sjukdom modell för olika typer av optikusneuropati, inklusive glaukom.
Abstract
Skador på synnerven kan leda till axonal degeneration, följt av en gradvis död retinala ganglion celler (RGC: er), vilket resulterar i oåterkallelig synnedsättning. Exempel på sådana sjukdomar hos människor inkluderar traumatisk optisk neuropati och synnerven degeneration i glaukom. Det kännetecknas av typiska förändringar i synnerven huvudet, progressiv synnerven degeneration och förlust av retinal ganglion celler, om okontrollerat, vilket leder till synnedsättning och blindhet.
Synnerven krossa (ONC) skada mus modell är en viktig experimentell sjukdom modell för traumatiska optikusneuropati, glaukom, etc. I denna modell krossa skada på synnerven leder till gradvis retinal ganglion celler apoptos. Denna sjukdom modellen kan användas för att studera generella processer och mekanismer för neuronal död och överlevnad, vilket är nödvändigt för utveckling av terapeutiska åtgärder. Dessutom kan farmakologiska och molekylära metoder kan användas i denna modell för att identifiera och testa potentiella terapeutiska reagenser för att behandla olika typer av optikusneuropati.
Här ger vi en steg för steg demonstration av (I) Baseline retrograd märkning av retinal ganglion celler (RGC: er) på dag 1, (II) synnerven krosskada på dag 4, (III) Samla in retinae och analysera RGC överlevnad vid dag 11, och (iv) representativt resultat.
Protocol
Alla utrustning och reagenser som används är sterila. Alla djurförsök har godkänts av Djurens skötsel och användning kommittén (ACUC) i NEI / NIH (djurstudie protokoll NEI-570) och utfördes enligt NIH riktlinjer och föreskrifter.
1. Baseline Retrograd Märkning av Retinal ganglion celler (RGC: er) vid dag 1
Syftet med detta förfarande är att märka näthinnans ganglion celler retrogradely genom att injicera ett neuralt spårämne färg i överlägsen colliculi av möss tre dagar innan synnerven krosskada. Färgen kommer att retrogradely tas upp av retinala ganglion celler och ger en markör för den levande RGC: er (Figur 1). Detta tillvägagångssätt ger reproducerbara märkning av livskraftiga RGC: er med lite variation 1-5.
- Djupt söva musen. Rengör håret på toppen av huvudet. Placera musen i en liten stereotaxic apparat. Skyddande salva appliceras på båda ögonen. Desinficera huvudet huden tre gånger med hjälp av en Jodoforimpregnerad och 70% alkohol skrubba.
- Gör ett snitt i huden för att exponera skallen, och hålla det torrt och rent med 3% väteperoxid.
- Identifiera och markera bregma. Borra ett hål ovanför överlägsna colliculi på 2,9 mm bakom bregma och 0,5 mm i sidled med mittlinjen på varje hemisfär 7. Under borrningen, tillämpa koksaltlösning till den plats där hålet borras för att förhindra sekundärvärme skada.
- Med hjälp av en stereotaxic mätinstrument och en Hamilton spruta, injicera FluoroGold neurala spårämne färgämne (1 l med 3% fluorokrom i koksaltlösning) mycket långsamt i den överlägsna colliculi varje hemisfär på ett djup av 1,6 mm från den beniga ytan av hjärnan.
- Sutur snittet webbplats. Ge en subkutan injektion av buprenorfin för smärtlindring.
- Flytta musen till en varm och torr yta och följa den tills den kan bibehålla en upprätt ställning, och returnera den till sitt hem bur. För de tre första dagarna efter märkning förfarandet är systemiska analgetika (t ex buprenorfin) och aktuell antibiotika salva två gånger dagligen och musen övervakas noggrant.
2. Synnerven krosskada på dag 4
Vid detta förfarande kommer vi att tillämpa en krosskada på synnerven att orsaka en primär skada på axoner (figur 2), vilket kommer att leda till en gradvis död retinal ganglion celler.
- Tre dagar efter spårämne färg ansökan, musen djupt sövd. Med hjälp av en dissekera mikroskop är bindhinna på ena ögat inristade på om de 4 klockan med hjälp av ett par av vårens sax.
- Försiktigt böja orbital muskler och lägg dem åt sidan. Exponera vita synnerven till sitt utträde ur ögongloben. Var noggrann med att inte skada något blodkärl.
- Med hjälp av ett par cross-action pincett, tillämpa en krosskada på synnerven ca 2 mm från ögongloben i ca 3 sekunder. Var mycket noga med att inte skada oftalmologiska artär kan orsaka blödning.
- Efter avslutad krosskada, är snittet sys.
- Innan musen återhämtar sig från anestesi, ge en subkutan injektion av buprenorfin för smärtlindring.
- Flytta musen till en varm och torr yta och övervaka den, tills den kan bibehålla en upprätt hållning och återlämna den till sitt hem bur. För de tre första dagarna efter den krosskada förfarandet är systemiska analgetika (t ex buprenorfin) och aktuell antibiotika salva två gånger dagligen och musen övervakas noggrant.
3. Skörda retinae och Analyze RGC överlevnad på dag 11
Syftet med detta förfarande är att skörda retinaeto analysera näthinnans överlevnad ganglion cell.
- Vid dag 11 (dag 7 efter ONC) är musen euthanized av CO 2 infusion och halsdislokation.
- Ögonen är enucleated med hjälp av en pincett genom att sätta press på bana.
- Ögonen är fasta i 4% paraformaldehyd lösning för två timmar och tvättas i PBS tre gånger. Dissekera näthinnan. Förfarandet för näthinnan dissektion har redan publicerats tidigare by Jove under 2010 av Gustmann, S. et al. 6, och kommer därför inte beskrivas här.
- Bilder av de överlevande näthinnans ganglion celler tas med hjälp av en fluorescerande mikroskop i definierade delar av näthinnan och retinal ganglion celltätheten kan räknas. En representant resultat av den fluorescens-märkta retinal ganglion celler med eller utan synnerven krosskada visas i figur 3.
4. Representativa resultat:
Att analysera näthinnan överlevnad ganglion celler, sju dagar efter synnerven krosskada var retinae skördade, fast, tillplattad och monterade. Retinal bilder är tagna med hjälp av en fluorescerande mikroskop. Jämfört med den oskadade normala retina (vänster, Normal), är antalet livsdugliga RGC: er (grön, retrogradely märkas av FluoroGold neurala spårämne färgämne sprutas in i överlägsen colliculi) signifikant lägre i retinae med en synnerven krosskada (höger, ONC) (Figur 3) .
Figur 1. Baseline bakåtsträvande märkning av retinal ganglion celler
För att räkna livskraftiga näthinnans ganglion celler vid olika tidpunkter efter synnerven krosskada, är de retinala ganglion celler märkta retrogradely genom att injicera ett neuralt spårämne färg (grön färg) i överlägsen colliculi i hjärnan tre dagar innan synnerven ( röd) krosskada. Sedan axoner av näthinnans ganglion celler bor i överlägsen colliculi kommer spårämne färgämnet tas upp av RGC: er retrogradely och ger en markör för de levande RGC: er.
Figur 2. Synnerven krosskada
För att analysera statusen på näthinnan ganglion cellöverlevnad, är en krosskada tillämpas på synnerven (röd) för att orsaka en primär skada på axoner. Detta kommer att leda till en gradvis död retinal ganglion celler. Tre dagar efter spårämne färg (grön) injektion, är musen sövd. Bindhinnan av ett öga är inristade. Avleder orbital muskler och lägg dem åt sidan. Exponera synnerven till sitt utträde ur ögongloben. Applicera en krosskada på synnerven ca 2 mm från ögongloben i ca 3 sekunder med ett par cross-åtgärder pincett.
Figur 3. Fluorescens-märkta retinal ganglion celler med eller utan synnerv krosskada
Att analysera näthinnan överlevnad ganglion celler, sju dagar efter synnerven krosskada var retinae skördade, fast, tillplattad och monterade. Retinal bilder är tagna med hjälp av en fluorescerande mikroskop. Jämfört med den oskadade normala näthinnan (vänster, Normal) var antalet livsdugliga RGC: er (grön, retrogradely märkas av FluoroGold neurala spårämne färgämne sprutas in i överlägsen colliculi) signifikant lägre i retinae med en synnerven krosskada (höger, ONC ) (Figur 3). Skala bar: 50 ìm
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Synnerven krosskada mus modell är användbar för att studera processen RGC död och överlevnad. Denna modell är också ofta används för att undersöka effekterna av olika reagenser och gener RGC apoptos och överlevnad. En fördel med denna modell är att den har en hög grad av reproducerbarhet med minimala variationer.
Det är dock särskild försiktighet krävs i flera steg i denna modell. Först när du gör synnerven skada synnerven krossa, är det viktigt att inte använda för mycket kraft och inte för att krossa för länge, eftersom de kan leda till skador på oftalmologiska artär och därför efterföljande retinal ischemi. Dessutom, när man försöker avslöja synnerven, bör man vara mycket försiktig med att inte skada andra blodkärl runt musen ögat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vår forskning stöds av Interna forskningsprogram NIH, National Eye Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic apparatus | ASI Instruments | SAS-4100 | |
| Dissecting microscope | World Precision Instruments, Inc. | PZMIV-BS | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel Blades #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Microdrill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| Suture needle | Fine Science Tools | 12050-03 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 16144-13 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Co | 88400 | |
| Gauze sponges | Office Depot | 674889 | |
| Fluorochrome | Sigma-Aldrich | 39286 | |
| Alcohol | Sigma-Aldrich | 459844 | 70% |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H3410 | 3% |
References
- Yoles, E. GM1 reduces injury-induced metabolic deficits and degeneration in the rat optic nerve. Investigative ophthalmology & visual science. 33, 3586-3591 (1992).
- Fisher, J. Vaccination for neuroprotection in the mouse optic nerve: implications for optic neuropathies. J Neurosci. 21, 136-142 (2001).
- Levkovitch-Verbin, H. RGC death in mice after optic nerve crush injury: oxidative stress and neuroprotection. Investigative ophthalmology & visual science. 41, 4169-4174 (2000).
- Li, Y. VEGF-B inhibits apoptosis via VEGFR-1-mediated suppression of the expression of BH3-only protein genes in mice and rats. The Journal of clinical investigation. 118, 913-923 (2008).
- Tang, Z. Survival effect of PDGF-CC rescues neurons from apoptosis in both brain and retina by regulating GSK3beta phosphorylation. The Journal of experimental medicine. 207, 867-880 (2010).
- Gustmann, S., Dunker, N. In vivo-like organotypic murine retinal wholemount culture. J Vis Exp. , (2010).
- Franklin, K., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. San Diego. (1997).
