Summary
Этот протокол показывает, как ретроградно этикетке ганглиозных клеток сетчатки, и как впоследствии сделать оптический травмы сокрушить силы, чтобы проанализировать сетчатки выживания клеток ганглия и апоптоза. Это экспериментальная модель болезни для различных типов невропатия зрительного нерва, в том числе глаукомы.
Abstract
Повреждение зрительного нерва может привести к дегенерации аксонального, а затем постепенное смерти ганглиозных клеток сетчатки (РГК), что приводит к необратимой потере зрения. Примерами таких заболеваний человека включают травматического невропатия зрительного нерва и зрительного нерва дегенерации при глаукоме. Для него характерны типичные изменения в головке зрительного нерва, прогрессивная оптическая дегенерации нерва, и потеря ганглиозных клеток сетчатки, если бесконтрольно, что приводит к потере зрения и слепоте.
Зрительный нерв раздавить (ОНК) в случае травмы мышиной модели является важной экспериментальной модели болезни травматического невропатия зрительного нерва, глаукома и др. В этой модели, размозжение зрительного нерва приводит к постепенному сетчатки апоптоза ганглиозных клеток. Это заболевание модель может быть использована для изучения общих процессов и механизмов гибели нейронов и выживания, который необходим для развития терапевтических мер. Кроме того, фармакологических и молекулярных подходы могут быть использованы в этой модели для идентификации и тестирования потенциальных терапевтических реагентов для лечения различных видов оптической невропатии.
Здесь мы предоставляем шаг за шагом демонстрацию (я) Базовый ретроградной маркировки ганглиозных клеток сетчатки (РГК) в день 1, (II), оптический нерв раздавить травм на 4 день, (III) Harvest сетчатки и анализировать РГК выживания на день 11, и (IV), представитель результат.
Protocol
Все оборудование и реагенты, используемые стерильны. Все эксперименты на животных, были утверждены уходу за животными и использование комитета (ACUC) на NEI / NIH (исследования на животных, протокол НОУ-570), а также были проведены в соответствии с НИЗ руководящие принципы и правила.
1. Базовый Ретроградная Маркировка ганглиозных клеток сетчатки (РГК) В день 1
Целью этой процедуры является этикетка ганглиозных клеток сетчатки ретроградно путем введения красителя нейронных трассирующими в верхний бугорок мышей за три дня до оптических травмы раздавить нерва. Краситель будет ретроградно рассмотрен ганглиозных клеток сетчатки и обеспечивает маркером жизни РГК (рис. 1). Такой подход позволяет получить воспроизводимые маркировки жизнеспособных РГК с небольшим изменением 1-5.
- Глубоко анестезию мыши. Чистая волос на верхней части головы. Наведите в небольшом стереотаксического аппарата. Защитные oinment применяется для обоих глаз. Лечить коже головы три раза в использовании йодофора и 70% спирта скраба.
- Сделайте надрез в коже, чтобы подвергать черепа, и держать его сухим и чистым, используя 3% перекиси водорода.
- Определите и отметьте брегмы. Просверлите отверстие выше верхний бугорок на 2,9 мм за темя и 0,5 мм сбоку от средней линии каждого полушария 7. При бурении применяют солевой на сайт, где бурится отверстие для предотвращения вторичного повреждения тепла.
- Использование стереотаксического устройства измерения и шприц Гамильтон, вводят FluoroGold нейронных трассирующими красителя (1 мкл 3% флуорохромами в физиологическом растворе) очень медленно в верхний бугорок каждого полушария на глубине 1,6 мм от костлявой поверхности мозга.
- Шовный разреза. Дайте подкожного введения бупренорфина для обезболивания.
- Подведите указатель мыши к теплой и сухой области и следить за ним, пока он не в состоянии поддерживать вертикальное положение, и вернуть его в исходное клетке. В течение первых трех дней после процедуры маркировки, системные анальгетики (например, бупренорфин) и актуальные мазь с антибиотиком даны два раза в день и мышь находится под пристальным контролем.
2. Оптические Травма Давка нерва на 4-й день
В этой процедуре, мы будем применять раздавить повреждения зрительного нерва вызывает первичного повреждения аксонов (рис. 2), что приведет к постепенной гибели ганглиозных клеток сетчатки.
- Через три дня после нанесения красителя трассирующими, мыши глубоко под наркозом. Использование рассекает микроскоп, конъюнктивы глаз вырезается примерно в 4:00 позицию, используя пару весной ножницами.
- Аккуратно отвлечь орбитальных мышц и положить их в сторону. Expose белый зрительный нерв при выходе ее из глаз земного шара. Будьте особенно внимательны, чтобы не повредить кровеносные сосуды.
- С помощью пары встречный иск щипцами, нанесите раздавить повреждение зрительного нерва примерно в 2 мм от глазного яблока в течение примерно 3 секунд. Будьте особенно внимательны, чтобы не повредить глазной артерии, чтобы вызвать кровотечение.
- После завершения размозжение, разрез зашивается.
- Перед мыши оправится от анестезии, дают подкожного введения бупренорфина для обезболивания.
- Подведите указатель мыши к теплой и сухой области и следить за ним, пока он не в состоянии поддерживать вертикальное положение и вернуть его в исходное клетке. В течение первых трех дней после процедуры травмы раздавить, системные анальгетики (например, бупренорфин) и актуальные мазь с антибиотиком даны два раза в день и мышь находится под пристальным контролем.
3. Урожай сетчатки и анализ РГК Выживание На 11 день
Целью этой процедуры является урожая retinaeto анализ сетчатки выживания клеток ганглия.
- В день 11 (7-й день после ONC), мышь эвтаназии СО 2 инфузии и шейки дислокации.
- Глаза извлекли ядра с помощью пара щипцов, применяя давление на орбиту.
- Глаза фиксировали в 4% параформальдегида решение в течение двух часов и промывали в PBS в три раза. Рассеките сетчатки. Процедура вскрытия сетчатки уже был опубликован ранее Юпитеру в 2010 году Gustmann, С. и соавт. 6, а, следовательно, не будут описаны здесь.
- Изображения выживших ганглиозных клеток сетчатки взяты использованием флуоресцентного микроскопа в определенных регионах сетчатки, и плотность клеток сетчатки ганглия могут быть подсчитаны. Представитель результате флуоресценции меченых ганглиозных клеток сетчатки с или без оптического травмы раздавить нерва показано на рисунке 3.
4. Представитель Результаты:
Для анализа выживания клеток сетчатки ганглия, через семь дней после травмы раздавить оптических нервов, сетчатки были собраны, фиксированные, сплющенные и смонтированы. Сетчатки изображения выполнены при помощи флуоресцентного микроскопа. По сравнению с неповрежденной нормальной тetina (слева, Normal), количество жизнеспособных РГК (зеленый, ретроградно помечены FluoroGold нейронных трассирующими краситель вводится в верхний бугорок) значительно ниже, сетчатки с оптической травмы раздавить нерва (справа, ОНК) (рис. 3) .
Рисунок 1. Базовый ретроградной маркировки ганглиозных клеток сетчатки
Для того, чтобы считать жизнеспособными ганглиозных клеток сетчатки в различные моменты времени после травмы раздавить оптических нервов, ганглиозных клеток сетчатки помечены ретроградно, вводя нейронных трассирующими красителя (зеленый цвет) в верхний бугорок в головном мозге за три дня до зрительного нерва ( красный) раздавить травм. С аксонов ганглиозных клеток сетчатки проживают в верхний бугорок, краситель трассирующими будет рассмотрен РГК ретроградно и обеспечивает маркером жизни РГК.
Рисунок 2. Оптические травмы раздавить нерва
В целях анализа состояния сетчатки выживания клеток ганглия, размозжение применяется к зрительному нерву (красный), чтобы заставить первичные повреждения аксонов. Это приведет к постепенной гибели ганглиозных клеток сетчатки. Через три дня после трассирующими красителя (зеленый) инъекции, мышь под наркозом. Конъюнктивы один глаз надрезанные. Deflect орбитальных мышц и положить их в сторону. Expose зрительного нерва при выходе ее из глаз земного шара. Применить раздавить повреждение зрительного нерва примерно в 2 мм от глазного яблока в течение 3 секунд с помощью пары встречный иск щипцами.
Рисунок 3. Флуоресценции меченых ганглиозных клеток сетчатки с или без оптического нерва травмы сокрушить
Для анализа выживания клеток сетчатки ганглия, через семь дней после травмы раздавить оптических нервов, сетчатки были собраны, фиксированные, сплющенные и смонтированы. Сетчатки изображения выполнены при помощи флуоресцентного микроскопа. По сравнению с неповрежденной нормальной сетчатки (слева, Normal), количество жизнеспособных РГК (зеленый, ретроградно помечены FluoroGold нейронных трассирующими краситель вводится в верхний бугорок) была значительно ниже в сетчатки с оптической травмы раздавить нерва (справа, ONC ) (рис. 3). Шкала бар: 50 мкм
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Зрительный нерв размозжение мышиной модели полезно изучить процесс РГК смертью и выживанием. Эта модель также часто используется для исследования влияния различных реагентов и генов апоптоза РГК и выживания. Одно из преимуществ этой модели является то, что он имеет высокую степень воспроизводимости с минимальными вариациями.
Тем не менее, то требуется особая осторожность в несколько этапов в этой модели. Во-первых, при создании оптических травмы раздавить нерва, важно не использовать слишком много сил и, чтобы не раздавить слишком долго, потому что они могут привести к повреждению артерий офтальмологические и поэтому последующие сетчатки ишемии. Кроме того, при попытке выставить зрительного нерва, следует проявлять большую осторожность, чтобы не повредить другие окружающие кровеносные сосуды мышей глаз.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Наше исследование опирается на Внутренние программы исследований NIH, Национального Института глаза.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic apparatus | ASI Instruments | SAS-4100 | |
| Dissecting microscope | World Precision Instruments, Inc. | PZMIV-BS | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel Blades #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Microdrill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| Suture needle | Fine Science Tools | 12050-03 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 16144-13 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Co | 88400 | |
| Gauze sponges | Office Depot | 674889 | |
| Fluorochrome | Sigma-Aldrich | 39286 | |
| Alcohol | Sigma-Aldrich | 459844 | 70% |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H3410 | 3% |
References
- Yoles, E. GM1 reduces injury-induced metabolic deficits and degeneration in the rat optic nerve. Investigative ophthalmology & visual science. 33, 3586-3591 (1992).
- Fisher, J. Vaccination for neuroprotection in the mouse optic nerve: implications for optic neuropathies. J Neurosci. 21, 136-142 (2001).
- Levkovitch-Verbin, H. RGC death in mice after optic nerve crush injury: oxidative stress and neuroprotection. Investigative ophthalmology & visual science. 41, 4169-4174 (2000).
- Li, Y. VEGF-B inhibits apoptosis via VEGFR-1-mediated suppression of the expression of BH3-only protein genes in mice and rats. The Journal of clinical investigation. 118, 913-923 (2008).
- Tang, Z. Survival effect of PDGF-CC rescues neurons from apoptosis in both brain and retina by regulating GSK3beta phosphorylation. The Journal of experimental medicine. 207, 867-880 (2010).
- Gustmann, S., Dunker, N. In vivo-like organotypic murine retinal wholemount culture. J Vis Exp. , (2010).
- Franklin, K., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. San Diego. (1997).
