Summary
Este protocolo mostra como retrogradamente rótulo células ganglionares da retina, e como posteriormente fazer uma lesão por esmagamento do nervo óptico, a fim de analisar a sobrevivência das células ganglionares da retina e apoptose. É um modelo de doença experimental para diferentes tipos de neuropatia óptica, incluindo glaucoma.
Abstract
Lesão do nervo óptico pode levar à degeneração axonal, seguido de uma morte gradual de células ganglionares da retina (RGCs), o que resulta em perda de visão irreversível. Exemplos de tais doenças em humanos incluem neuropatia óptica traumática e degeneração do nervo óptico no glaucoma. É caracterizada por alterações típicas na cabeça do nervo óptico, degeneração progressiva do nervo óptico e perda de células ganglionares da retina, se não controlada, levando à perda de visão e cegueira.
O esmagamento do nervo óptico (ONC) modelo do rato é um modelo de lesão importante doença experimental de neuropatia óptica traumática, glaucoma, etc Neste modelo, a lesão por esmagamento do nervo óptico leva a gradual da retina apoptose de células ganglionares. Este modelo de doença pode ser usado para estudar os processos gerais e aos mecanismos de morte neuronal e sobrevivência, que é essencial para o desenvolvimento de medidas terapêuticas. Além disso, as abordagens farmacológica e molecular pode ser utilizada neste modelo para identificar e testar o potencial terapêutico reagentes para tratar diferentes tipos de neuropatia óptica.
Aqui, fornecemos uma demonstração passo a passo (I) rotulagem de base retrógrada das células ganglionares da retina (RGCs) no dia 1, (II) lesão por esmagamento do nervo óptico no dia 4, (III) Colheita da retina e analisar a sobrevivência RGC no dia 11, e (IV) Resultado Representante.
Protocol
Todos os equipamentos e reagentes utilizados são estéreis. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Animal Care e Use Committee (ACUC) no NEI / NIH (animal protocolo de estudo NEI-570), e foram realizados de acordo com as diretrizes do NIH e regulamentos.
1. Rotulagem de base retrógrada de células ganglionares da retina (RGCs) no dia 1
O objetivo deste procedimento é a rotular as células ganglionares da retina retrogradamente pela injeção de um corante traçador neural no colículo superior dos camundongos três dias antes da lesão do nervo óptico esmagamento. O corante será retrogradamente tomadas pelas células ganglionares da retina e proporciona um marcador para o RGCs vivos (Figura 1). Esta abordagem produz rotulagem reprodutível de RGCs viável, com pouca variação 1-5.
- Profundamente anestesiar o mouse. Limpar o cabelo no alto da cabeça. Posicione o mouse em um pequeno aparelho estereotáxico. Oinment protetora é aplicada em ambos os olhos. Desinfectar a pele da cabeça três vezes cada um usando um iodóforo e um matagal álcool 70%.
- Faça uma incisão na pele para expor o crânio, e mantê-lo seco e limpo com água oxigenada de 3%.
- Identificar e marcar o bregma. Faça um furo acima do colículo superior a 2,9 mm do bregma e 0,5 mm lateral à linha média de cada hemisfério 7. Durante a perfuração, aplicar soro fisiológico para o local onde o buraco é perfurado para evitar lesões de calor secundário.
- Usando um dispositivo de medição estereotáxica e uma seringa de Hamilton, injetar o traçador corante FluoroGold neural (1 ml de 3% em solução salina Fluorocromo) muito lentamente no colículo superior de cada hemisfério, a uma profundidade de 1,6 mm da superfície óssea do cérebro.
- Sutura no local da incisão. Dar uma injeção subcutânea de buprenorfina para analgesia.
- Mova o mouse para uma área quente e seco e monitorá-lo até que ele é capaz de manter uma postura ereta, e devolvê-lo à sua gaiola. Para os três primeiros dias após o procedimento de rotulagem, analgésicos sistêmicos (por exemplo, buprenorfina) e pomada antibiótica tópica são dadas duas vezes por dia eo mouse é acompanhado de perto.
2. Lesão por esmagamento do nervo óptico no dia 4
Neste procedimento, vamos aplicar uma lesão por esmagamento do nervo óptico para causar um dano primário ao axônios (Figura 2), o que levará a uma morte gradual das células ganglionares da retina.
- Três dias após a aplicação de corante traçador, o mouse é profundamente anestesiado. Usando um microscópio de dissecação, a conjuntiva de um olho é incisada mais ou menos na posição das 4 horas usando uma tesoura primavera.
- Suavemente desviar os músculos orbitais e colocá-los de lado. Expor o nervo óptico branco em sua saída do globo ocular. Tome muito cuidado para não danificar qualquer vasos sanguíneos.
- Com a ajuda de um par de cruz ação fórceps, aplicar uma lesão por esmagamento do nervo óptico em cerca de 2 mm do globo ocular por aproximadamente 3 segundos. Tome muito cuidado para não danificar a artéria oftálmica para causar sangramento.
- Após a conclusão da lesão por esmagamento, a incisão é suturada.
- Antes o mouse recupera da anestesia, dar uma injeção subcutânea de buprenorfina para analgesia.
- Mova o mouse para uma área quente e seco e monitorá-lo, até que ele é capaz de manter uma postura ereta e devolvê-lo à sua gaiola. Para os três primeiros dias após o procedimento lesão por esmagamento, analgésicos sistêmicos (por exemplo, buprenorfina) e pomada antibiótica tópica são dadas duas vezes por dia eo mouse é acompanhado de perto.
3. Colher as retinas e analisar Survival RGC No Dia 11
O objetivo deste procedimento é a colheita do retinaeto analisar a sobrevivência das células ganglionares da retina.
- No dia 11 (dia 7 após ONC), o mouse é sacrificado por infusão de CO 2 e deslocamento cervical.
- Olhos são enucleados com a ajuda de uma pinça, aplicando pressão para a órbita.
- Os olhos são fixados em solução de paraformaldeído a 4% por duas horas e lavados com PBS por três vezes. Dissecar a retina. O procedimento de dissecção retina já foi publicado anteriormente por Jove em 2010 por Gustmann, S. et al. 6, e, portanto, não serão descritas aqui.
- Imagens dos sobreviventes células ganglionares da retina são tomadas através de um microscópio de fluorescência em regiões definidas da retina, ea densidade de células ganglionares da retina pode ser contado. Um resultado representativo da fluorescência marcado células ganglionares da retina com ou sem lesão do nervo óptico esmagar é mostrado na Figura 3.
4. Resultados representativos:
Para analisar a sobrevivência das células ganglionares da retina, sete dias após a lesão do nervo óptico esmagar, a retina foram colhidos, fixo, achatada e montado. Imagens da retina foram tiradas com um microscópio fluorescente. Comparado com o r ileso normaisetina (esquerda, Normal), o número de RGCs viáveis (verde, retrogradamente marcados pelo corante FluoroGold traçador neural injetado no colículo superior) é significativamente menor na retina com uma lesão do nervo óptico paixão (direita, ONC) (Figura 3) .
Figura 1. Rotulagem de base retrógrada das células ganglionares da retina
, A fim de contar o viáveis células ganglionares da retina em diferentes momentos após a lesão do nervo óptico esmagar, as células ganglionares da retina são rotulados retrogradamente pela injeção de um traçador neural corante (cor verde) para o colículo superior no cérebro, três dias antes do nervo óptico ( vermelho paixão) lesão. Uma vez que os axônios das células ganglionares da retina residir no colículo superior, o corante traçador será retomada pelo RGCs retrogradamente e fornece um marcador para o RGCs vida.
Figura 2. Lesão por esmagamento do nervo óptico
A fim de analisar o status de sobrevivência de células ganglionares da retina, uma lesão por esmagamento é aplicada ao nervo óptico (vermelho) para causar um dano primário ao axônios. Isto levará a uma morte gradual das células ganglionares da retina. Três dias após a injeção de corante marcador (verde), o mouse está anestesiado. Conjuntiva de um olho é incisada. Desviar os músculos orbitais e colocá-los de lado. Expor o nervo óptico em sua saída do globo ocular. Aplique uma lesão por esmagamento do nervo óptico em cerca de 2 mm do globo ocular por aproximadamente 3 segundos usando um par de cruz ação fórceps.
Figura 3. Fluorescência marcado células ganglionares da retina com ou sem lesão do nervo óptico esmagar
Para analisar a sobrevivência das células ganglionares da retina, sete dias após a lesão do nervo óptico esmagar, a retina foram colhidos, fixo, achatada e montado. Imagens da retina foram tiradas com um microscópio fluorescente. Comparado com o retina ileso normal (esquerda, Normal), o número de RGCs viáveis (verde, retrogradamente marcados pela neural FluoroGold traçador corante injetado no colículo superior) foi significativamente menor na retina com uma lesão do nervo óptico paixão (direita, ONC ) (Figura 3). Barra de escala: 50 mm
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Discussion
O nervo óptico modelo de lesão por esmagamento murino é útil para estudar o processo de morte RGC e sobrevivência. Este modelo é também muitas vezes utilizado para investigar os efeitos de diferentes reagentes e genes na apoptose RGC e sobrevivência. Uma vantagem deste modelo é que ele tem um alto grau de reprodutibilidade, com variações mínimas.
No entanto, cuidados especiais são necessários vários passos neste modelo. Em primeiro lugar, ao fazer a lesão por esmagamento do nervo óptico, é essencial para não usar muita força e não para esmagar por muito tempo, porque eles podem levar a danos à artéria oftálmica ou seja, após isquemia de retina. Além disso, ao tentar expor o nervo óptico, deve-se tomar muito cuidado para não danificar os vasos sanguíneos que cercam o olho mouse.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Nossa pesquisa é apoiada pelo Programa de Pesquisa Intramural do, NIH National Eye Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic apparatus | ASI Instruments | SAS-4100 | |
| Dissecting microscope | World Precision Instruments, Inc. | PZMIV-BS | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel Blades #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Microdrill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| Suture needle | Fine Science Tools | 12050-03 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 16144-13 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Co | 88400 | |
| Gauze sponges | Office Depot | 674889 | |
| Fluorochrome | Sigma-Aldrich | 39286 | |
| Alcohol | Sigma-Aldrich | 459844 | 70% |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H3410 | 3% |
References
- Yoles, E. GM1 reduces injury-induced metabolic deficits and degeneration in the rat optic nerve. Investigative ophthalmology & visual science. 33, 3586-3591 (1992).
- Fisher, J. Vaccination for neuroprotection in the mouse optic nerve: implications for optic neuropathies. J Neurosci. 21, 136-142 (2001).
- Levkovitch-Verbin, H. RGC death in mice after optic nerve crush injury: oxidative stress and neuroprotection. Investigative ophthalmology & visual science. 41, 4169-4174 (2000).
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- Tang, Z. Survival effect of PDGF-CC rescues neurons from apoptosis in both brain and retina by regulating GSK3beta phosphorylation. The Journal of experimental medicine. 207, 867-880 (2010).
- Gustmann, S., Dunker, N. In vivo-like organotypic murine retinal wholemount culture. J Vis Exp. , (2010).
- Franklin, K., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. San Diego. (1997).
